目的:黑色素瘤是最具侵袭性的皮肤肿瘤,在过去的几十年中,黑色素瘤的发病率一直在增加。特别是皮肤黑色素瘤占全世界新发恶性肿瘤病例的1.6%,且发病率在世界上以每年2-7%的速率增长。传统的疗法如外科手术、化疗、放疗的治疗效果仍然不理想,因此研究人员致力于寻找对肿瘤细胞影响大并对正常细胞毒性最小的药物。近年来,中草药有效成分的作用越来越受到全世界的关注,其对肿瘤作用的研究是肿瘤研究领域的新方向。小豆蔻明作为草豆蔻的种子中提取的生物碱类单体成分,具有广泛的生物活性和抗肿瘤作用。目前,研究已证实小豆蔻明对多种肿瘤细胞具有抑制作用,但仍无小豆蔻明针对黑色素瘤细胞作用的研究。本研究主要通过小豆蔻明处理黑素瘤M14细胞系,观察其对M14细胞增殖、凋亡及相关凋亡蛋白的影响,探讨其可能的机制。方法:1.细胞培养。将黑色素瘤M14细胞培养于含10%胎牛血清的1640培养基,放入37℃,5%CO2的培养箱中培养。2.使用MTS法检测小豆蔻明对黑色素瘤M14细胞增殖的影响。实验设3组:空白对照组只加培养基无细胞无小豆蔻明,阴性对照组为有含细胞的培养基且无小豆蔻明,实验组为含有细胞的培养基,培养基加有以下浓度的小豆蔻明(30、60、90、120μmol/L),每组6个复孔。培养24h,48h,72h后加入MTS检测小豆蔻明对黑色素瘤M14细胞增殖活力的影响,计算不同浓度药物浓度下细胞的存活率。3.应用流式细胞术检测小豆蔻明对黑色素瘤M14细胞凋亡的影响。实验设2组:阴性对照组为含有细胞的培养基且无小豆蔻明,实验组为含有细胞的培养基,培养基加有以下浓度的小豆蔻明(30、60、90μmol/L)。培养24小时后进行检测。4.应用实时荧光定量PCR法(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR)检测测经小豆蔻明药物处理后的M14细胞凋亡相关基因(BAX和BCL2)在mRNA水平的表达。实验设2组阴性对照组为含有细胞的培养基且无小豆蔻明,实验组为含有细胞的培养基,培养基加有以下浓度的小豆蔻明(30、60、90μmol/L)。培养24小时后提取RNA进行检测。5.应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测经小豆蔻明药物处理后的凋亡相关蛋白(BAX,BCL2,Cleaved Caspase8,Cleaved Caspase9、Cleaved PARP以及P65)的表达情况。实验设2组:阴性对照组为含有细胞的培养基且无小豆蔻明,实验组为含有细胞的培养基,培养基加有以下浓度的小豆蔻明(30、60、90μmol/L)。培养24小时后提取蛋白进行检测。结果:1.MTS结果显示,经过不同浓度的小豆蔻明处理24h后黑色素瘤M14细胞的存活率分别为(87.9±4.2)%,(78.2±2.4)%、(70.1±2.2)%、(44.0±3.2)%,通过两两比较,各实验组与阴性对照组间的差异具有统计学意义(P0.05);小豆蔻明处理48小时的存活率分别为(76.0±1.6)%、(35.5±2.2)%、(32.0±1.3)%、(23.5±1.7)%,经两两比较,各实验组与阴性对照组间的差异具有统计学意义(P0.05);小豆蔻明处理72小时的存活率分别为(40.1±1.3)%、(34.6±2.3)%、(23±2.2)%、(18.3±2.0)%,经两两比较,各实验组与阴性对照组间的差异具有统计学意义(P0.05)。2.流式细胞术结果显示浓度不同的小豆蔻明处理黑色素瘤M14细胞24小时后细胞凋亡情况,随着小豆蔻明剂量的增加,Annexin V阳性细胞(早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞之和)的比例也在逐步增加。3.RT-qPCR结果显示,浓度不同的小豆蔻明处理黑色素瘤M14细胞24小时,在mRNA水平BAX基因的表达量依次为1.595±0.141,2.201±0.388,2.411±0.442,阴性对照组为1.002±0.087,经两两比较对照组与30μmol/L,60μmol/L,90μmol/L组间差异差异具有统计学意义(P0.05),其余各组之间差异无统计学意义(P0.05);在mRNA水平BCL2基因的表达量依次为0.755±0.044,0.617±0.004,0.536±0.074,阴性对照组为1.008±0.180,经两两比较阴性对照组与60μmol/L、90μmol/L组间差异有统计学意义(P0.05),其余各组之间差异无统计学意义(P0.05)。4.Western blot结果显示:黑色素瘤M14细胞经不同浓度的小豆蔻明处理24h,BAX蛋白表达量依次为0.0.326±0.017,0.585±0.013,0.643±0.005,阴性对照组为0.307±0.008,经过两两比较各实验组与阴性对照组之间差异均有统计学意义(P0.05);BCL2蛋白表达量依次为0.501±0.007,0.465±0.011,0.409±0.01,阴性对照组为0.537±0.007,经过两两比较各实验组与阴性对照组之间差异均有统计学意义(P0.05);Cleaved Caspase 8蛋白表达量依次为0.592±0.023,0.872±0.022,0.949±0.0259,阴性对照组为0.437±0.003,经过两两比较各实验组与阴性对照组之间差异均有统计学意义(P0.05);Cleaved Caspase 9蛋白表达量依次为0.666±0.013,0.915±0.013,0.979±0.007阴性对照组为0.507±0.014,经过两两比较各实验组与阴性对照组之间差异均有统计学意义(P0.05);Cleaved PARP蛋白表达量依次为0.320±0.006,0.900±0.025,0.979±0.009,阴性对照组为0.175±0.003,经过两两比较各实验组与阴性对照组之间差异均有统计学意义(P0.05);P65蛋白表达量依次为0.720±0.006,0.630±0.008,0.439±0.003,阴性对照组为0.811±0.011,经过两两比较各实验组与阴性对照组之间差异均有统计学意义(P0.05)。结论:1.在一定浓度和时间范围内,小豆蔻明对黑色素瘤M14细胞具有明显的增殖抑制作用,且呈时间-剂量依赖性。2.在一定浓度和时间范围内,小豆蔻明可诱导黑色素瘤M14细胞凋亡,且随着浓度的升高,诱导凋亡作用越显著。3.小豆蔻明诱导黑色素瘤M14细胞的凋亡作用可能与内源性和外源性凋亡通路有关。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.5
【部分图文】：
同浓度的小豆蔻明作用不同时间对黑色素瘤 M14 细率的影响liferation inhibition of melanoma M14 cells after of cardamonin in different concentrations and times式细胞术结果显示浓度不同的小豆蔻明处理黑色素黑色素瘤 M14 细胞凋亡情况如图所示，随着小豆蔻
的小豆蔻明作用 24h 黑色素瘤 M14 细 treated with different concentration of caapoptosis was detected by flow cytometr结果显示，浓度不同的小豆蔻明处理黑RNA 水平 BAX 基因的表达量依次411±0.442，阴性对照组为 1.002±0.087，60μmol/L, 90μmol/L 组间差异差异具有之间差异无统计学意义（P＞0.05）；在 m次为 0.755±0.044，0.617±0.004，0.5360，经两两比较对照组与 60μmol/L, 90μ0.05），其余各组之间差异无统计学意
同浓度的小豆蔻明作用 24h 黑色素瘤 M14 细胞的4 Cells treated with different concentration of cardamoapoptosis was detected by flow cytometryqPCR 结果显示，浓度不同的小豆蔻明处理黑色素在 mRNA 水平 BAX 基因的表达量依次为 188，2.411±0.442，阴性对照组为 1.002±0.087，经两ol/L, 60μmol/L, 90μmol/L 组间差异差异具有统计余各组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；在 mRN达量依次为 0.755±0.044，0.617±0.004，0.536±0.078±0.180，经两两比较对照组与 60μmol/L, 90μmol/L义（P＜0.05），其余各组之间差异无统计学意义（P
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本文编号：
2864832
