Gibson Assembly改良分子克隆系统构建及应用与黑素母细胞SV40T重编程的研究

发布时间：2021-02-21 15:46

　　本课题研究包含了三个分子克隆系统改建的技术性课题,两个黑色素瘤基因治疗的课题和一个黑色素瘤全基因组耐药基因筛查的课题,这三个课题同时也是三个技术课题成果的应用和进一步证明。此外还在课题组原有的黑色素母细胞可逆性永生化的研究基础上进行了SV40-T抗原对黑色素母细胞永生化重编程的研究。各个部分课题相对独立完整又相互关联。Daniel Gibson开发的Gibson DNA Assembly是一种基于双链DNA分子同源序列进行无缝拼接的DNA连接方式,相较于传统的基于内切酶位点的分子克隆连接方式有其独特的优势。本研究基于DNA Gibson Assembly法,突破以往分子克隆的多种局限性,进行了三种分子克隆技术的革新：一、发明了无需重组的腺病毒构建系统；二、创建了多段干扰序列一步合成共表达的siRNA表达系统；三、建成了低成本,全基因组覆盖,简便易行,随机无偏性的siRNA文库。本课题组在黑色素细胞的干细胞生物学,肿瘤生物学方面有多年的研究积累。技术的开发是为了应用,上述分子克隆表达系统构建完成后,我们将这些技术探索性地用于黑色素瘤基因治疗和耐药靶点筛查的研究,一方面在科研实践中验证所革... 

【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市

【文章页数】：121 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图３－Ｌ?ｉｍｃ２３和ｉｍｃｐｏｏｌ细胞裸鼠在体皮内移植２周生成增生物??

Ｉｍｃｘ＋ＡｄＦｌｉｐ?４１０６６５３??图３－１８．?ｐ５３巧光报告结巧分析ｉｍｃｘ去除ＳＶ４０－Ｔ前６?ｐ５３的表达变化??Ｏｖｅｒ?ｅｘｐｒｅｓｓ?ｔｈｅ?ｆｏｕｒ?

ＳＶ４０－Ｔ黑色素谱系细胞的干细胞生物学研究主要依赖转基因动物模型和器官培养，一直??缺乏稳定的细胞模型，原因在于黑色素母细胞或干细胞原代分离纯化和体外培养比较??困难。细胞永生化技术是克服原代培养困难建立稳定细胞株的常用方法。ＳＶ４０－Ｔ抗??原是常用的永生化外源基因。本实验室长期从事黑色素谱系细胞的研究，之前成功分??离原代的黑色素母细胞，可逆性导入ＳＶ４０－Ｔ抗原，建立了便于传代扩增的黑素母细??胞株ｉｍｃ２３，ｉｍｃｐｏｏｌ等，相关成果已发表（Ｃｏｎ航化加’ｏｎ仿ｔｏ地Ａｅｎｋ片ｅｓ??ａ?民ｅｐｅｒｔｏｉｒｅ?ｏｆ?Ｍｏｕｓｅ?Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ?Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ?ｗｉｔｈ?Ｄｉｓｔｉｎｃｔ?Ｍｄ幻ｎｏｇｅｎｉｃ?Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ??Ｐｏ?化?ｎｔｉａ！．?Ｊｏｕｍａ！?ｏｆ?Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ?Ｄｅｒｍａ?化?ｌｏｇｙ?１３２?（１０）?：?２４?７９－２４８３?）。??本实验在对该细胞株的生物学性状进行进一步检测，探讨ＳＶ４０－Ｔ抗原永生化黑??素母细胞的可行性，安全性及具体机制时，发现了非常有趣的现象，即经ＳＶ４０－Ｔ抗??原永生化后的黑素母细胞能在体形成类似畴胎瘤的组织块，提示ＳＶ４０－Ｔ抗原可能对??黑素母细胞具有重编程的作用。??

【参考文献】：
期刊论文
[1]β-catenin与小鼠毛囊衰老性变化相关[J]. 邓芳,郭海英,支轶,连小华,杨恬.  基础医学与临床. 2012(10)



本文编号：3044567