山奈酚对小鼠黑色素瘤自杀基因系统的增效作用

发布时间：2017-04-20 22:19

  本文关键词：山奈酚对小鼠黑色素瘤自杀基因系统的增效作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 建立小鼠黑色素瘤B16细胞HSV1-tkGFP/GCV自杀基因系统,为直观研究中药活性成分山奈酚对该自杀基因系统的增效作用的实验研究打下基础；证实中药活性成分山奈酚对小鼠黑色素瘤B16细胞HSV1-tkGFP/GCV自杀基因系统具有增效作用。 方法： 1.B16细胞株HSV1-tkGFP/GCV自杀基因系统的建立：首先扩增转有质粒pLXSN-tkGFP的大肠杆菌,用Ultra Pure QIAGEN Plasmid Midi Kit抽提质粒；然后参照Lipofectamine2000转染试剂说明书,将重组质粒pLXSN-tkGFP和pLXSN-DsRed2分别转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经过G418筛选、流式分选和有限稀释法,最终获得对G418有抗性并且能自发稳定红绿荧光的单克隆细胞株,分别命名为B16-tkGFP和B16-RFP。用5μmol/L、50μmol/L和500μmol/LGCV验证B16-tkGFP细胞tk基因的表达。将单克隆细胞株B16-tkGFP(能稳定表达绿色荧光蛋白GFP)和B16-RFP(能稳定表达红色荧光蛋白RFP)按不同比例(20%、40%和60%B16-tkGFP)混合,加GCV处理后采用MTT法检测总细胞的抑制率；另外在荧光显微镜下观察混合细胞中B16-tkGFP细胞和B16-RFP细胞的变化,特别是未携带tk基因的B16-RFP细胞被杀伤的情况,以评价该重组自杀基因系统HSV1-tkGFP/GCV的自杀效应及其旁杀伤效应。 2.山奈酚对B16细胞株HSV1-tkGFP/GCV自杀基因系统的体外增效作用：先用MTT法找到山奈酚不影响B16细胞生长的安全浓度和作用时间,再用Di1-Calcein双染料流式检测法分析安全浓度范围内的山奈酚对B16细胞GJIC功能的影响,以以检测绿色荧光细胞数量与荧光双阴性受体细胞比值,作为评价GJ功能的指标。应用MTT法检测山奈酚联合GCV对100%tk+和50%tk+增效的量效关系,并利用金正均Q值法分析和判断山奈酚与HSV1-tkGFP/GCV系统联合的作用效果；荧光显微镜观察山奈酚对HSV1-tkGFP/GCV系统旁杀伤效应的影响。 3.山奈酚对小鼠黑色素瘤B16细胞株HSV1-tk/GCV自杀基因系统的体内增效作用：将活化的B16-tkGFP细胞和B16-RFP细胞按等比例混合后接种于C57BL/6J小黑鼠右腋皮下,待出瘤(接种后第8天)后将其随机分为致瘤模型组、GCV50mg/kg组、山奈酚40mg/kg组和山奈酚40mg/kg联合GCV50mg/kg组,每组10只小黑鼠,次日起按各给药组要求每天腹腔注射给药0.2ml/只,联合组的GCV和山奈酚分开给药,连续给药13天；同时致瘤模型组小黑鼠每天相应腹腔注射生理盐水0.2ml/只。在给药期间,每三天量一次肿瘤大小和称一次体重,以观测各组药物对小黑鼠的体重变化和给药后的抑瘤效果(n=10)。实验结束后解剖取出各组肿瘤、胸腺和脾脏,称重后用10%中性甲醛固定备用。各组分别取出部分肿瘤组织制作石蜡切片,HE染色后观察各组肿瘤组织形态变化。 结果： 1.将提取的质粒pLXSN-tkGFP和质粒pLXSN-RFP分别转染入B16细胞,最终成功筛选出对G418具有抗性的单克隆细胞株B16-tkGFP(能自发稳定的绿色荧光)和单克隆细胞株B16-RFP (能自发稳定的红色荧光)；经GCV杀伤实验证实了转入的tk基因在B16-tkGFP细胞中能正常稳定地表达。B16-tkGFP细胞和B16-RFP细胞的混合细胞共培养实验中,MTT检测结果及荧光显微观察图片表明了该重组自杀基因系统具有一定的旁杀伤效应(P0.01)。 2.0μimol/L～12μmol/L山奈酚作用48h对B16生长增殖没有影响,荧光传递实验中用0μmol/L、3μmol/L、6μmol/L和12μmol/L山奈酚处理B16细胞48h后,绿色荧光细胞(凡)与双阴性受体细胞(A3)的比值(A4/A3)分别为0.056±0.006、0.072±0.013、0.079±0.009和0.094±0.013。3μmol/L山奈酚联合3μmol/L、6μmol/L和12μmol/L的GCV对100%B16-tkGFP细胞作用72h可表现出协同增效作用；6.25μmol/LGCV联合6.25μmol/L和12.5μmol/L的山奈酚对100%B16-tkGFP细胞作用96h也可表现出协同增效作用；浓度为6.25μmol/L的山奈酚联合6.25μmol/L的GCV对含50%B16-tkGFP的混合细胞作用96h能表现出协同增效作用。荧光图片也显示3μmol/L、6μmol/L和12μmol/L山奈酚联合40μmol/LGCV对50%B16-tkGFP作用72h表现出明显的“旁观者效应”,并且随着联合组山奈酚浓度的增加,旁杀伤效应逐渐显著。 3.含50%B16-tkGFP混合细胞致瘤的动物实验结果显示GCV联合山奈酚组的肿瘤增长倍数小于单独GCV组(P0.05),苏木素-伊红染色结果显示GCV组和山奈酚联合GCV组肿瘤细胞密度均较模型组低；并且表现出较模型组和GCV组更明显的炎症淋巴细胞浸润现象；山奈酚联合GCV组更明显。而以上现象,GCV联合山奈酚组比GCV组更明显。 结论： 山奈酚对HSV1-tkGFP/GCV自杀基因系统治疗小鼠黑色素瘤具有一定增效作用,且有可能是通过增强细胞的GJIC功能来实现的,体内实验可能与山奈酚调节机体免疫功能有一定关系,但具体机制还需进一步研究。
【关键词】：自杀基因系统 旁观者效应 缝隙连接通讯 黑色素瘤 山奈酚
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-13
• 第一章 文献研究13-23
• 第一节 肿瘤自杀基因治疗的研究进展13-20
• 一、肿瘤基因治疗的研究进展13-15
• 二、肿瘤自杀基因疗法的研究概述15-17
• 三、GJIC与自杀基因系统的旁杀伤效应17-18
• 四、自杀基因疗法在治疗黑色素瘤方面的研究18-20
• 第二节 山奈酚药理作用研究进展20-23
• 一、山奈酚的概述20
• 二、山奈酚在抗肿瘤方面的研究20-23
• 第二章 实验研究23-55
• 第一节 B16细胞株HSV1-tkGFP/GCV自杀基因系统的建立23-32
• 一、质粒的扩增和提取23-25
• 二、重组自杀基因系统的建立和鉴定25-30
• 三、实验讨论30-32
• 第二节 山奈酚对B16细胞株HSV1-tkGFP/GCV系统的体外增效作用32-45
• 一、山奈酚对B16细胞株缝隙连接功能的影响初探32-37
• 二、山奈酚对B16细胞株HSV1-tkGFP/GCV系统的增效作用37-43
• 三、实验讨论43-45
• 第三节 山奈酚对B16细胞株HSV1-tk/GCV系统的体内增效作用45-55
• 一、体内山奈酚对HSV1-tk/GCV系统治疗小鼠黑色素瘤的影响45-51
• 二、HE染色法观察山奈酚增效实验各组肿瘤组织变化51-53
• 三、实验讨论53-55
• 第三章 结语55-59
• 参考文献59-65
• 附录65-79
• 附录Ⅰ：英文缩略语65-67
• 附录Ⅱ：HSV1-tkGFP/GCV系统旁杀伤效应验证结果67-71
• 附录Ⅲ：山奈酚增强HSV1-tk/GCV系统旁杀伤效应的结果71-75
• 附录Ⅳ：动物实验肿瘤病理组织学检查结果(HE染色法)75-79
• 在校期间发表的论文79-80
• 致谢80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：319636