β-catenin对恶性黑色素瘤细胞A375的增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响

发布时间：2017-04-23 02:10

  本文关键词：β-catenin对恶性黑色素瘤细胞A375的增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景： 恶性黑色素瘤是一种较常见的恶性肿瘤，好发于皮肤部，恶性程度高，平均生存期约30.3个月，且发病率呈逐年上升趋势。目前，治疗恶性黑色素瘤主要的手段有手术及抗肿瘤治疗（化疗、放疗、生物治疗），但其疗效均较差。于是寻求一种新的有效治疗措施有着重要意义。近年来，发现Wnt/β-catenin信号通路与多种恶性肿瘤发生发展均有密切联系，但其作用机制没有被完全认知。现已认为，Wnt/β-catenin信号转导通路的核心蛋白β-catenin在细胞浆内异常聚积是Wnt/β-catenin信号转导通路激活的标志。本实验利用含有β-catenin特异序列RNA干扰慢病毒沉默β-catenin蛋白的表达，以此阻断Wnt/β-catenin信号转导通路，观察β-catenin沉默对恶性黑色素瘤A375细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响。 目的： 探讨通过沉默Wnt/β-catenin信号通路中的关键蛋白β-catenin，观察β-catenin对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖、侵袭、迁移以及凋亡的影响，从而为恶性黑色素瘤的治疗提供依据。 方法： 1.制作干扰慢病毒液：β-catenin-RNAi-LV(β-catenin干扰慢病毒液)和β-catenin-negative-LV (空载体慢病毒液)。分别感染人恶性黑色素瘤A375细胞，得到的稳定感染细胞株分别标记为A375-RNAi、A375-negative。采用Western Blot法检测感染后的A375-RNAi、A375-negative细胞中β-catenin蛋白表达水平，并以未感染的细胞作对照。 2. MTT法分别检测A375-RNAi、A375-negative细胞增殖能力，并以未感染的细胞作对照。 3.采用细胞平板克隆形成实验检测A375-RNAi、A375-negative细胞平板克隆形成能力，并以未感染的细胞作对照。 4.采用Transwell法检测A375-RNAi、A375-negative细胞体外趋化侵袭、迁移能力，并以未感染的细胞作对照。 5.流式细胞术亚G1峰法检测A375-RNAi、A375-negative细胞的凋亡率，并以未感染的细胞作对照。 结果： 1. Western Blot结果显示：β-catenin在人恶性黑色素瘤A375细胞中高表达，β-catenin在A375-RNAi细胞中的表达量下降，A375-RNAi细胞β-catenin蛋白的表达量较未感染的A375细胞下降约55.1%（P0.05），证实β-catenin被β-catenin-RNAi-LV有效沉默；A375-negative细胞内β-catenin蛋白表达量与A375细胞无明显差异（P0.05）。 2. MTT结果显示：A375-RNAi细胞与A375-negative细胞、A375细胞相比增殖活性均降低(P＜0.05)；A375-negative细胞较A375细胞增殖活性无明显差异（P＞0.05）。 3.细胞平板克隆实验检测结果：A375-RNAi细胞与A375-negative细胞、A375细胞平板克隆形成能力相比均减低(P＜0.05)；A375-negative细胞较A375细胞平板克隆形成能力无明显差异（P＞0.05）。 4. Transwell结果显示：A375-RNAi细胞与A375-negative细胞、A375细胞侵袭、迁移能力相比均显著下降(P＜0.05)，A375-negative细胞较A375细胞的侵袭、迁移能力无明显差异（P＞0.05）。 5.流式细胞术结果显示：A375-RNAi细胞与A375-negative细胞、A375细胞相比凋亡率明显增高(P＜0.05)；A375-negative细胞较A375细胞凋亡率无显著差异性(P＞0.05)。 结论： 1.慢病毒载体介导siRNA能有效沉默人黑色素细胞瘤A375细胞内β-catenin蛋白的表达。 2.下调β-catenin表达能使人黑色素细胞瘤A375细胞增殖变缓，细胞克隆形成能力减弱，细胞侵袭、迁移能力下降，细胞凋亡率增加。β-catenin有望成为治疗人恶性黑色素瘤有效靶点。
【关键词】：恶性黑色素瘤 β-catenin siRNA 增殖 侵袭 迁移 凋亡
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文缩略词表10-11
• 第1章 引言11-14
• 第2章 材料与方法14-27
• 2.1 材料14-19
• 2.1.1 主要试剂14-15
• 2.1.2 仪器设备及耗材15-16
• 2.1.3 实验对象16
• 2.1.4 慢病毒 RNAi 包装16
• 2.1.5 主要试剂的配置16-19
• 2.2 实验方法19-26
• 2.2.1 实验分组19
• 2.2.2 细胞培养19-21
• 2.2.3 慢病毒载体 siRNA 感染 A375 细胞21-22
• 2.2.4 Western Blot22-24
• 2.2.5 MTT 法检测 A375、A375-negative、A375-RNAi 细胞的增殖情况24
• 2.2.6 平板细胞克隆形成实验检测 A375 、 A375-negative 、A375-RNAi 细胞的克隆形成能力24-25
• 2.2.7 Transwell 法检测 A375、A375-negative、A375-RNAi 细胞的侵袭及迁移情况25-26
• 2.2.8 流式细胞学 Sub-G1峰法检测细胞凋亡26
• 2.3 统计方法26-27
• 第3章 结果27-34
• 3.1 倒置荧光显微镜下观察各组 A375 细胞形态27-28
• 3.2 Western Blot 检测β-catenin 表达28
• 3.3 MTT 法检测慢病毒载体介导 siRNA 对 A375 细胞增殖作用28-29
• 3.4 平板细胞克隆形成实验29-30
• 3.5 Transwell 法检测细胞侵袭及迁移能力30-32
• 3.5.1 Transwell 法检测细胞侵袭能力30-31
• 3.5.2 Transwell 法检测细胞迁移能力31-32
• 3.6 流式细胞术检测慢病毒载体介导 siRNA 对 A375 细胞凋亡影响32-34
• 第4章 讨论34-40
• 4.1 细胞增殖36-37
• 4.2 细胞侵袭与迁移37-38
• 4.3 细胞凋亡38-40
• 第5章 结论40-41
• 致谢41-42
• 参考文献42-45
• 攻读学位期间的研究成果45-46
• 综述46-53
• 参考文献51-53

【参考文献】

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1 陈瑾;DKK1在黑素瘤中的表达及其对黑素瘤发生发展的调控的实验研究[D];重庆医科大学;2011年

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本文编号：321655