沙利度胺对体外培养的人正常真皮成纤维细胞增殖活性、胶原合成及MMP-1、TIMP-1表达的影响

发布时间：2017-04-24 00:10

  本文关键词：沙利度胺对体外培养的人正常真皮成纤维细胞增殖活性、胶原合成及MMP-1、TIMP-1表达的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：真皮成纤维细胞是皮肤真皮层中最重要的细胞，它在分泌以及合成纤维和细胞外基质（以胶原为主）中饰演重要角色，这对于正常真皮结缔组织的构成、皮肤创伤修复和真皮纤维化疾病等的发生具有极其重要的意义。皮肤纤维化是因为真皮成纤维细胞活动反常致使以胶原蛋白为主要成分的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在皮肤组织中过量堆积，很难被机体降解的异常增生现象。纤维化性疾病包括累及多种器官的疾病，例如间质性肺纤维化、硬皮病、肝纤维化（肝硬化）、肾脏纤维化等，虽然它们的发病机制大多数不明以及临床表现也各有不同，但它们有一个共同特点就是受损组织中细胞外基质（以胶原为主）过度沉积。越来越多的研究证明沙利度胺具有抑制动物纤维化模型或人肺、肝、心等器官纤维化的作用。如外文文献研究报道[1]，沙利度胺可以通过抑制肺组织成纤维细胞的增殖以及减少胶原的合成，从而起到抑制小鼠肺间质纤维化的作用。虽然近年来不断有关于沙利度胺对动物或人肺、滑膜、骨髓等成纤维细胞的研究报道，但沙利度胺对正常人皮肤成纤维细胞有什么样影响尚未见报道。 本实验通过体外培养人正常真皮成纤维细胞，观察沙利度胺对体外培养的人正常真皮成纤维细胞的增殖情况、胶原合成以及表达基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）的影响。目的在初步探讨沙利度胺对人正常真皮成纤维细胞的作用机制，希望为其临床应用于皮肤纤维化性疾病的可能性以及更进一步的研究提供可靠的理论依据。 方法： 1通过酶联合消化法体外培养人正常真皮成纤维细胞，并利用免疫组化法对细胞进行鉴定，取第五代细胞进行试验。 2将不同浓度的沙利度胺加入体外培养的人正常真皮成纤维细胞，待沙利度胺作用24小时后，通过MTT比色法检测不同浓度组沙利度胺(10-3～10-11mol/L，共9组)对人正常真皮成纤维细胞增殖活性的影响，然后筛查出沙利度胺对成纤维细胞作用的有效浓度，为后续实验分组所用。 3依据MTT结果分为实验组和对照组，通过碱水解法检测沙利度胺作用24小时后人正常真皮成纤维细胞羟脯氨酸的含量，间接反应胶原合成的情况。 4依据MTT结果分为实验组和对照组，通过荧光定量PCR法检测沙利度胺对正常人真皮成纤维细胞表达MMP-1mRNA，TIMP-1mRNA的影响。 5统计学分析：采用SPSS15.0统计学软件对实验数据进行统计处理，实验数据首先经正态性检验，符合正态分布的可采用单因素方差分析，否则按照非参数检验中的Mann-Whitney检验，P＜0.05有统计学意义。 6实验步骤严格按照说明书进行。 结果： 1MTT结果显示：沙利度胺在一定浓度（10-3～10-6mol/L）范围内能抑制成纤维细胞体外增殖，各浓度实验组分别与空白对照组相比均具有统计学意义（P＜0.05），各实验组间两两比较，，其中10-3与10-4mol/L两浓度组抑制最明显，与其它两组(10-5与10-6mol/L两组)相比有显著差异（P＜0.05）。而10-7～10-11mol/L5个浓度组与对照组相比虽有轻微变化，但无统计学意义（P＞0.05）。 2沙利度胺对人正常真皮成纤维细胞上清液中羟脯氨酸含量的影响： 沙利度胺在各个实验浓度（10-4、10-5、10-6、10-7mol/L）作用细胞24小时后，上清液中羟脯氨酸的含量较对照组均降低，经方差分析各实验组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。其中10-4mol/L组羟脯氨酸含量最低，与其它实验组对比有统计学意义（P＜0.05）。 3PCR法检测沙利度胺对人正常真皮成纤维细胞表达MMP-1mRNA的影响： 沙利度胺不同浓度实验组（10-4、10-5、10-6、10-7mol/L）处理成纤维细胞24小时后，MMP-1mRNA表达均有不同程度的升高，经方差分析，各实验组分别与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。且四个实验组两两分别比较，差异也具有统计学意义（P＜0.05）。 4PCR法检测沙利度胺对人正常真皮成纤维细胞表达TIMP-1mRNA的影响： 沙利度胺不同实验组（浓度分别为10-4、10-5、10-6、10-7mol/L）干预成纤维细胞24小时后，可见TIMP-1mRNA表达均有不同程度降低，经方差分析，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。且各实验组之间两两对比差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 结论： 1本研究证实沙利度胺在一定浓度范围内可以抑制人正常真皮成纤维细胞的增殖。 2沙利度胺在一定浓度范围内能够抑制人正常真皮成纤维细胞胶原的合成。 3沙利度胺在一定浓度范围内能够在mRNA水平上上调人正常真皮成纤维细胞中MMP-1表达以及抑制TIMP-1的表达。 4沙利度胺因其抑制人正常真皮成纤维细胞增殖活性、胶原合成、TIMP-1表达以及促进MMP-1表达，为其应用于皮肤纤维化性疾病的可能性以及更进一步的研究提供可靠的理论依据。
【关键词】：成纤维细胞 沙利度胺 细胞增殖 胶原合成 MMP-1、TIMP-1
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R751
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11-12
• 材料与方法12-22
• 结果22-25
• 附图25-29
• 附表29-31
• 讨论31-35
• 结论35
• 参考文献35-39
• 综述 沙利度胺与纤维化疾病39-52
• 参考文献46-52
• 致谢52-53
• 个人简历53

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 杨浩,王春婷,吴玉梅,李静雯,鞠躬;细胞特性状态及细胞数与OD值的关系探讨[J];动物医学进展;2002年05期

2 王峙;赵丽丹;张p

本文编号：323257