抗黑色素瘤scFv-mTNF-α免疫细胞因子的构建及其抗肿瘤活性研究

发布时间：2021-07-10 03:19

　　目的:构建抗黑色素瘤免疫细胞因子ScFv-mTNF-α,在大肠杆菌中表达并纯化具有黑色素瘤特异性结合活性和杀伤活性的融合蛋白,为黑色素瘤的抗体导向治疗打下基础。方法:为了避免使用天然型TNF-α所造成的强烈的副作用,我们尝试用高生物学活性、低毒性的突变型TNF-α（mTNF-α）将天然型TNF-α替代,与抗黑色素瘤单链抗体构建新型、高效、低毒的抗黑色素瘤免疫细胞因子原核表达载体pGEX4T-1/ScFv-mTNF-α,待鉴定正确后,通过在大肠杆菌中诱导表达、纯化,用制备的融合蛋白在体外对L929细胞进行TNF活性的检测,对B16-F10黑色素瘤细胞进行体外杀伤实验,在体内对荷黑色素瘤Balb/c小鼠进行导向治疗研究,以期获得具有临床应用潜能的抗黑色素瘤免疫细胞因子。首先鉴定本室保存的两个质粒pGEX-4T-1/ScFv和pGEX-4T-1/mTNF-α,并对其进行测序,用获得的测序结果推导出对应的氨基酸序列,查阅文献获得linker序列,将模拟得到的理论融合蛋白片断通过Insight II软件,采用同源建模、分子力学和分子动力学等方法预测蛋白质三维结构。设计含有限制性内切酶和linke... 

【文章来源】：中国人民解放军军事科学院北京市

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

ScFv酶切鉴定结果

- 25 -处可见明显条带，与预期的pGEX-4T-1质粒和mTNF-α片断一致（图1.2和图1.3）。M 1 2 1 2 M M图1.2、ScFv酶切鉴定结果 图1.3、mTNF-α酶切鉴定结果1-2：pGEX-4T-1/ScFv质粒 1-2：pGEX-4T-1/mTNF-α质粒M：Marker M：Marker（2）ScFv基因片断和mTNF-α基因片段测序结果①ScFv基因测序结果：1 ATGCAGGTGC AGCTGGTGGA GTCTGGGGCA GAGCTTGTGA AGCCAGGGGC CTCAGTCAAG61 TTGTCCTGCA CAGCTTCTGG CTTCAACATT AAAGACACCT ATATGCACTG GGTGAAGCAG

图1.4、scFv部分测序图谱因测序结果：AC GTAAGCCTGT AGCCCATGTT GTAGCAAACC CTCAAGCTGA GGGGCAGCGA ACCGCCGGGC CAATGCCCTC CTGGCCAATG GCGTGGAGCT GAGAGATAGG TGCCATCAGA GGGCCTGTAC CTCATCTACT CCCAGGTCCT CTTCAAGGGCC CCTCCACCCA TGTGCTCCTC ACCCACACCA TCAGCCGCAT CGCCGTCTCCA AGGTCAACCT CCTCTCTGCC ATCAAGAGCC CCTGCCAGAG GGAGACCCCTG AGGCCAAGCC CTGGTATGAG CCCATCTATC TGGGAGGGGT CTTCCAGCGTG ACCGACTCAG CGCTGAGATC AATCGGCCCG ACTATCTCGA CTTTGCCGAGG TCTACTTTGG GATCATTGCC TTCTGA

【参考文献】：
期刊论文
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[8]一种新型人TNF表达质粒的构建及在大肠杆菌中的高表达[J]. 何晓龙,常金丽,蔡武城,喻红,吕群,赵寿元,王成海,林葆城,朱鹤年.  生物化学与生物物理进展. 1994(03)

博士论文
[1]分泌型单链双功能抗体基因修饰的T淋巴细胞抗肝癌活性的实验研究[D]. 程虹.第四军医大学 1999



本文编号：3275078