致瘤性γ疱疹病毒裂解复制相关宿主蛋白的筛选：PTK7促进病毒释放
发布时间：2022-01-25 12:53
背景:在器官移植受者中,Epstein-Barr病毒（Epstein-Barr virus,EBV）感染可诱导致死性移植术后并发症——移植后淋巴增殖性疾病（post-transplant lymphoproliferative disorders,PTLD）的发生,严重影响受者和移植物的预后。EBV是一种人类γ疱疹病毒,也是人们发现的首个致瘤病毒,其感染与一些恶性肿瘤的发生发展密切相关,包括B细胞淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等淋巴细胞或上皮细胞来源的恶性肿瘤。在免疫抑制如医源性免疫抑制的情况下,EBV的致瘤风险大大上升。另一种常见的人类γ疱疹病毒卡波济肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV）也是重要的致瘤病毒。γ疱疹病毒致瘤机制复杂,阐明病毒和宿主之间的相互作用和调控机制对认识和治疗相关恶性肿瘤意义重大。EBV和KSHV由于其种属特异性只能感染人类或部分灵长类动物,不利于体内实验的开展,且EBV和KSHV缺乏可进行有效的体外裂解性复制的细胞系,极大地限制了病毒的研究工作。鼠γ疱疹病毒68（murine ga...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：129 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
KSHV、EBV、MHV-68、HVS四种γ疱疹病毒基因组及其功能比较
浙江大学博士学位论文第一部分实验材料102.2实验材料2.2.1细胞和病毒2.2.1.1HEK293T细胞（人源胚胎肾细胞293T）和Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）均购自ATCC（AmericanTypeCulturecollection），在实验室冻存。细胞培养液为含有10%FBS和1%青霉素/链霉素双抗的DMEM（Dulbecco"sModifiedEagleMedium）完全培养液，培养条件为37℃，5%CO2。2.2.1.2野生型MHV-68病毒购自ATCC，在实验室冻存。重组型MHV-68报告病毒MHV-68-M3FL由合作实验室构建[65]。该报告病毒在tRNA-1和tRNA-2之间插入了一段由M3启动子调控的萤火虫荧光素酶表达元件（图2.1）。以上病毒均以0.01-0.05的感染复数（multiplicityofinfection，MOI）感染Vero细胞实现病毒扩增。图2.1重组型MHV-68报告病毒MHV-68-M3FL结构示意图。TR，terminalrepeat，末端重复序列；pM3，M3启动子序列；FL，萤火虫荧光素酶报告基因。2.2.2主要试剂DMEM高糖培养液：购自美国Corning公司；
浙江大学博士学位论文第一部分实验方法16病毒裂解性复制可导致重组型MHV-68报告病毒MHV-68-M3FL的萤火虫荧光素酶的表达。我们在预实验中对比了荧光素酶活性结果和空斑实验法测得的病毒滴度，发现这两者线性相关（图2.2），荧光素酶活性可有效代表病毒滴度。因此，我们无需通过病毒空斑实验逐个检测每孔病毒的滴度，只需要批量检测各孔荧光素酶活性即可知道病毒裂解性复制水平，这为高通量筛选提供了机会。图2.2荧光素酶活性与病毒滴度的相关性。（1）60ngcDNA表达质粒利用Lipofectamine2000转染试剂转染入384孔板中的HEK293T细胞中。（2）24小时后，重组型MHV-68-M3FL病毒感染HEK293T细胞（MOI=0.01）。（3）为尽可能消除cDNA表达产物对M3启动子的直接影响，在病毒感染50小时后取10μl上清感染新的384孔板中的正常HEK293T细胞。（4）18小时后，检测新感染的HEK293T细胞培养孔的荧光素酶活性。在384孔板中加入30μlBright-GloLuciferaseAssayReagent，2分钟后检测荧光素酶活性。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Regulation of Wnt/β-catenin signaling by herpesviruses[J]. Kevin J Zwezdaryk,Joseph A Combs,Cindy A Morris,Deborah E Sullivan. World Journal of Virology. 2016(04)
[2]Recent insights in the pathogenesis of post-transplantation lymphoproliferative disorders[J]. Julie Morscio,Thomas Tousseyn. World Journal of Transplantation. 2016(03)
本文编号：3608572
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：129 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
KSHV、EBV、MHV-68、HVS四种γ疱疹病毒基因组及其功能比较
浙江大学博士学位论文第一部分实验材料102.2实验材料2.2.1细胞和病毒2.2.1.1HEK293T细胞（人源胚胎肾细胞293T）和Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）均购自ATCC（AmericanTypeCulturecollection），在实验室冻存。细胞培养液为含有10%FBS和1%青霉素/链霉素双抗的DMEM（Dulbecco"sModifiedEagleMedium）完全培养液，培养条件为37℃，5%CO2。2.2.1.2野生型MHV-68病毒购自ATCC，在实验室冻存。重组型MHV-68报告病毒MHV-68-M3FL由合作实验室构建[65]。该报告病毒在tRNA-1和tRNA-2之间插入了一段由M3启动子调控的萤火虫荧光素酶表达元件（图2.1）。以上病毒均以0.01-0.05的感染复数（multiplicityofinfection，MOI）感染Vero细胞实现病毒扩增。图2.1重组型MHV-68报告病毒MHV-68-M3FL结构示意图。TR，terminalrepeat，末端重复序列；pM3，M3启动子序列；FL，萤火虫荧光素酶报告基因。2.2.2主要试剂DMEM高糖培养液：购自美国Corning公司；
浙江大学博士学位论文第一部分实验方法16病毒裂解性复制可导致重组型MHV-68报告病毒MHV-68-M3FL的萤火虫荧光素酶的表达。我们在预实验中对比了荧光素酶活性结果和空斑实验法测得的病毒滴度，发现这两者线性相关（图2.2），荧光素酶活性可有效代表病毒滴度。因此，我们无需通过病毒空斑实验逐个检测每孔病毒的滴度，只需要批量检测各孔荧光素酶活性即可知道病毒裂解性复制水平，这为高通量筛选提供了机会。图2.2荧光素酶活性与病毒滴度的相关性。（1）60ngcDNA表达质粒利用Lipofectamine2000转染试剂转染入384孔板中的HEK293T细胞中。（2）24小时后，重组型MHV-68-M3FL病毒感染HEK293T细胞（MOI=0.01）。（3）为尽可能消除cDNA表达产物对M3启动子的直接影响，在病毒感染50小时后取10μl上清感染新的384孔板中的正常HEK293T细胞。（4）18小时后，检测新感染的HEK293T细胞培养孔的荧光素酶活性。在384孔板中加入30μlBright-GloLuciferaseAssayReagent，2分钟后检测荧光素酶活性。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Regulation of Wnt/β-catenin signaling by herpesviruses[J]. Kevin J Zwezdaryk,Joseph A Combs,Cindy A Morris,Deborah E Sullivan. World Journal of Virology. 2016(04)
[2]Recent insights in the pathogenesis of post-transplantation lymphoproliferative disorders[J]. Julie Morscio,Thomas Tousseyn. World Journal of Transplantation. 2016(03)
本文编号：3608572
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/pifb/3608572.html
最近更新
教材专著
