RASSF1A基因通过调控细胞凋亡、细胞周期和AKT/mTOR信号通路抑制黑色素瘤A375细胞的机制研究

发布时间：2022-02-16 09:27

　　[RASSF1A基因在黑色素瘤细胞和组织中表达下调]RASSFIA是定位于肿瘤高频杂合性丢失区域3p21.3位点的抑瘤基因,编码一个微管相关蛋白。该基因在多种实体瘤组织中因启动子高甲基化而表达沉默,是迄今为止在肿瘤组织中甲基化程度最高的基因之一。前期多项研究指出,除了在上皮性肿瘤中发生甲基化之外,RASSF1A基因在恶性黑色素瘤细胞中也存在高频甲基化,提示该基因在黑色素瘤的发生过程中也可能存在表达异常。在本研究中,我们首次采用免疫组织化学及western blot的方法研究了RASSFIA基因在正常皮肤组织、皮肤色素痣以及恶性黑色素瘤组织和细胞系中的表达,结果发现,RASSF1A蛋白在正常皮肤色素细胞和色素痣细胞中高表达,而在恶性黑色素瘤组织中表达下调甚至缺失,并与肿瘤的转移呈负相关。RASSFIA蛋白在非转移性黑色素瘤细胞系中有微弱表达,而在转移性黑色素瘤细胞系中表达缺失。该结果证实了RASSFIA在黑色素瘤组织和细胞中表达下调,强烈提示RASSFIA参与了黑色素瘤的发生与演进过程。[RASSFIA基因具有抑制黑色素瘤细胞生长、增殖的作用]以往关于RASSFIA基因功能的研究绝大部分... 

【文章来源】：中南大学湖南省211工程院校985工程院校教育部直属院校

【文章页数】：105 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩写词简表
目录
技术路线
第一章 前言
第二章 材料与方法
    1 材料
        1.1 细胞
        1.2 菌株和质粒载体
        1.3 试剂
        1.4 主要仪器
    2 方法
        2.1 免疫组化
        2.2 pIRES-RASSF1A载体的构建
        2.3 细胞RNA制备
        2.4 培养细胞总蛋白制备
        2.5 线粒体和胞浆蛋白的抽提
        2.6 SDS-PAGE凝胶电泳
        2.7 基因瞬时转染
        2.8 siRNA瞬时转染
        2.9 稳定转染A375细胞系的建立
        2.10 免疫荧光实验
        2.11 细胞生长曲线测定
        2.12 平板集落形成实验
        2.13 裸鼠成瘤实验
        2.14 FCM检测细胞周期和细胞凋亡
        2.15 Hoechst33258染色检测细胞凋亡
        2.16 人类全基因组表达谱芯片杂交(由博奥生物有限公司完成)
        2.17 差异表达基因的raltime RT-PCR验证
第三章 结果
    第一部分 RASSF1A基因在黑色素瘤细胞和组织中的表达
        3.1.1 RASSF1A基因在黑色素瘤组织中的表达
        3.1.2 RASSF1A表达与恶黑临床相关分析
        3.1.3 RASSF1A蛋白在黑色素瘤细胞系中的表达
    第二部分 RASSF1A基因过表达对A375细胞的影响
        3.2.1 RASSF1A真核表达载体的构建
        3.2.2 RASSF1A稳定转染黑色素瘤细胞系的建立
        3.2.3 RASSF1A对A375细胞生长与增殖的影响
        3.2.4 RASSF1A对A375细胞集落形成能力的影响
        3.2.5 RASSF1A对A375细胞形态影响
        3.2.6 RASSF1A抑制A375细胞裸鼠移植瘤的形成
        3.2.7 RASSF1A促进A375细胞凋亡
        3.2.8 RASSF1A对A375细胞周期的影响
        3.2.9 RASSF1A对细胞周期调控分子表达的影响
        3.2.10 RASSF1A通过降低cyclin D1蛋白稳定性抑制其表达
    第三部分 RASSF1A对黑色素瘤细胞基因表达谱的影响
        3.3.1 RASSF1A基因对A375细胞基因表达谱的影响
        3.3.2 差异表达基因的生物信息学分析
        3.3.3 差恂表达基因KEGG和BIOCARTA数据库pathway分析
        3.3.4 差异表达基因的进一步验证
    第四部分 RASSF1A调控恶黑细胞凋亡和细胞周期的分子机制
        3.4.1 RASSF1A上调ASK1表达激活p38 MAPK信号途径
        3.4.2 RASSF1A对cytochrome c亚细胞分布的影响
        3.4.3 RASSF1A诱导恶黑细胞凋亡的作用部分依赖于ASK1
        3.4.4 RASSF1A抑制了AKT/mTOR信号通路的活化
        3.4.5 AKT可以逆转RASSF1A对信号通路的调节作用
第四章 讨论
    4.1 RASSF1A蛋白在恶黑组织和细胞系中表达下调
    4.2 RASSF1A具有抑制恶黑A375细胞生长与增殖的作用
    4.3 RASSF1A下调cyclin D1和p-Rb表达,引起A375细胞周期G1-S期阻滞
    4.4 RASSF1A促进A375细胞凋亡
    4.5 RASSF1A调控的A375差异基因表达谱的构建
    4.6 RASSF1A通过上调ASK1促进细胞凋亡的分子机制
    4.7 RASSF1A抑制了恶黑细胞AKT/mTOR信号通路
    4.8 Summary:RASSF1A抑制了恶黑细胞生物学表型的分子机制
结论
参考文献
综述
致谢
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]恶性黑色素瘤的研究进展[J]. 乌新春,段晰所.  承德医学院学报. 2008(03)
[2]人类表观基因组计划[J]. 黄庆,郭颖,府伟灵.  生命的化学. 2004(02)
[3]北京城区1993-1997年恶性肿瘤发病率分析[J]. 祝伟星,王启俊,李玲,邢秀梅.  肿瘤防治杂志. 2003(08)



本文编号：3627729