DAMPs介导ALA光动力诱导皮肤鳞癌细胞免疫原性死亡的研究

发布时间：2017-05-14 12:13

  本文关键词：DAMPs介导ALA光动力诱导皮肤鳞癌细胞免疫原性死亡的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景皮肤鳞状细胞癌(Squamous Cell Carcinoma,SCC)是人类常见皮肤肿瘤之一,约占全部非黑素细胞皮肤癌的20%。SCC多见于老年人,好发于头面部,外阴及外生殖器。常规采用手术、激光、冷冻、放疗等直接去除或破坏肿瘤组织,但存在组织结构破坏性大、易复发、复发后再次治疗困难等问题。由于SCC免疫原性弱,宿主免疫功能缺陷或低下无法诱导机体产生有效的抗肿瘤免疫应答,是SCC复发和转移的主要原因。因此,寻找理想的抗肿瘤疗法--增强肿瘤细胞的免疫原性,杀伤肿瘤细胞的同时,能够激发机体抗肿瘤免疫反应,突显必要。光动力治疗(Photodynamic Therapy, PDT)是光敏剂积累于病变组织随后用相应波长的光源照射,激发光化学反应导致病变组织破坏的治疗方法。5-氨基酮戊酸光动力疗法(ALA-PDT)已经广泛的应用于治疗皮肤科各种疾病,包括皮肤癌和癌前病变如日光性角化病和非黑素皮肤病肿瘤(鲍温病、浅表基底细胞癌)。光动力抗肿瘤机制包括：(1)直接杀死肿瘤细胞(2)破坏肿瘤的脉管系统(3)肿瘤浸润的免疫细胞的细胞毒作用(4)迅速募集和激活免疫细胞启动适应性免疫应答。本课题组于1996年在国内率先开展ALA-PDT治疗浅表性皮肤肿瘤及癌前病变的临床应用性研究并取得较为满意的临床疗效,进一步研究还发现ALA-PDT具有明显地抑制肿瘤生长的作用并可预防肿瘤的发生。近年来“免疫原性死亡”这一概念的提出,使得医学界对抗原在肿瘤细胞表面表达或释放以及机体对肿瘤的识别有了新的认识。免疫原性细胞死亡依赖于一种被叫做损伤相关分子模式(danger-associated molecular patterns, DAMPs)的分子信号,来激活固有免疫应答进一步诱导特异性抗肿瘤免疫反应。“免疫原性死亡”与正常死亡方式不同,在杀伤肿瘤细胞的同时,激发机体产生强大的抗肿瘤免疫应答。研究发现针对肿瘤局部病灶PDT治疗的同时,可以诱导局部或系统性抗肿瘤免疫反应,甚至导致远处转移病灶受到抑制同时降低其复发率。本课题组前期研究结果证实ALA-PDT在治疗肿瘤病灶的同时诱导肿瘤细胞ICD,但具体机制尚未明确。本研究旨在探讨ALA-PDT是否能够诱导肿瘤细胞表达DAMPs增强肿瘤细胞免疫原性,诱导肿瘤细胞免疫原性死亡及其分子机制。目的探索ALA-PDT是否能够诱导皮肤鳞癌细胞表达DAMPs增强皮肤鳞癌细胞免疫原性及其分子机制。包括(1)探索ALA-PDT诱导小鼠皮肤鳞癌细胞高表达DAMPs的最佳时间点及最佳照光剂量。(2)确证DAMPs在ALA-PDT增强皮肤鳞癌细胞免疫原性过程中的关键作用。(3)探索DAMPs介导ALA-PDT增强皮肤鳞癌细胞免疫原性的分子机制。方法(1)选择不同照光剂量及不同时间点检测ALA-PDT处理的肿瘤细胞DAMPs的表达情况：将小鼠皮肤鳞癌细胞株PECA与0.5mM的ALA孵育5h,以不同剂量(0.25J/cm2、0.5J/cm2、1J/cm2和2J/cm2)处理PECA细胞,收集不同时间点(PDT后1h、3h、6h、9h、12h)的细胞和细胞上清。采用western blot检测细胞内HSP70、 HMGB1和CRT的表达,采用western blot检测细胞膜上HSP70和CRT的表达,采用Elisa检测上清中PECA细胞分泌的HSP70和HMGB1。(2)确证DAMPs在ALA-PDT处理的PECA诱导DCs表型及功能过程中的作用：分离培养小鼠骨髓树突状细胞(Dendritic cells, DCs), ALA-PDT处理后(0.5mM,5h,0.5J/cm2)的PECA与DCs共孵育,DAMPs抑制组分别加入相应的抑制剂,24h后收集DCs与细胞上清。采用流式细胞术检测DCs表面分子标志MHCⅡ、CD80和CD86,采用Elisa检测细胞上清中DCs分泌的IL-12和INF-γ。(3)分析ALA-PDT经DAMPs介导,是否通过TLRs-NF-κB途径增强肿瘤细胞免疫原性：分离培养小鼠骨髓DCs, ALA-PDT处理后(0.5mM,5h,0.5J/cm2)的PECA与DCs共孵育,DAMPs抑制组分别加入相应的抑制剂,24h后收集DCs。采用western blot检测DCs的TLR2和TLR4及IκB、pIκB和细胞核中NF-κB的表达情况。结果(1)不同照光剂量及不同时间点ALA-PDT处理的肿瘤细胞DAMPs的表达情况：ALA-PDT处理的PECA细胞内和细胞膜DAMPs的表达水平上调,至0.5J/cm2PDT后6h达到高峰,ALA-PDT处理的PECA细胞HSP70和HMGB1分泌量上调,至2J/cm2 PDT后6h达到高峰。(2) DAMPs在ALA-PDT处理的PECA诱导DCs表型及功能过程中的作用：PDT-DCs表面分子标志MHCⅡ、CD80和CD86的表达量较未致敏组明显增加,仍低于LPS刺激组。当HSP70、HMGB1和CRT分别或同时被抑制时PDT-DCs表面分子标志MHCⅡ、CD80和CD86的表达量较前明显降低。PDT-DCs的IL-12和INF-γ的分泌量较未致敏组明显增加,当HSP70、 HMGB1和CRT分别或同时被抑制时INF-γ的分泌量较前明显降低。当HSP70、HMGB1和CRT分别被抑制时IL-12的分泌量较前有下降趋势,当HSP70、HMGB1和CRT同时被抑制时IL-12的分泌量较前明显降低。(3) ALA-PDT经DAMPs介导,通过TLRs-NF-κB途径增强肿瘤细胞免疫原性:PDT-DCs表面的TLR2和TLR4的表达明显上调,当HSP70、HMGB1和CRT分别或同时被抑制时,PDT-DCs表面的TLR2的表达水平降低。当HSP70和HMGB1分别被抑制时,PDT-DCs表面的TLR4的表达水平降低,当CRT被抑制时,TLR4的表达水平未见明显改变。当HSP70、HMGB1和CRT同时被抑制时,表面的TLR4的表达水平降低。PDT-DCs的I-κB、pI-κB及细胞核内的NF-κB表达上调。当HSP70、HMGB1分别被抑制时,PDT-DCs的I-κB、pI-κB及细胞核内的NF-κB表达水平降低,但是当CRT被抑制时,PDT-DCs的I-κB、pI-κB及细胞核内的NF-κB表达水平未见明显改变。HSP70、HMGB1和CRT同时被抑制时,PDT-DCs的I-κB、pI-κB及细胞核内的NF-κB表达水平明显降低。结论(1) ALA-PDT可诱导皮肤鳞癌细胞PECA表达DAMPs,细胞膜HSP70和CRT的表达至0.5J/cm2 PDT后6h达到高峰,HSP70和HMGB1分泌量2J/cm2 PDT后6h达到高峰。(2) DAMPs在增强皮肤鳞癌细胞免疫原性,刺激DCs细胞成熟,诱导肿瘤细胞免疫原性死亡过程中发挥至关重要的作用。(3) DAMPs介导ALA-PDT增强皮肤鳞癌细胞免疫原性的主要分子机制是活化了DCs的TLRs-NF-κB信号通路。
【关键词】：皮肤鳞状细胞癌 5-氨基酮戊酸光动力疗法 损伤相关分子模式 免疫原性细胞死亡 树突状细胞
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 缩略词表13-14
• 前言14-19
• 参考文献17-19
• 第一部分 ALA-PDT对皮肤鳞癌细胞表达DAMPs的影响19-32
• 1 引言19
• 2 实验材料19-20
• 3 实验方法20-24
• 4 结果24-28
• 5. 讨论28-30
• 6 结论30
• 7 参考文献30-32
• 第二部分 DAMPs介导ALA-PDT增强皮肤鳞癌免疫原性32-43
• 1 引言32
• 2 材料与方法32-33
• 3 实验方法33-35
• 4 结果35-39
• 5 讨论39-41
• 6 结论41
• 7 参考文献41-43
• 第三部分 DAMPs通过TLRs-NF-κB途径介导ALA-PDT增强皮肤鳞癌免疫原性43-53
• 1 引言43
• 2材料与方法43-44
• 3方法44-47
• 4 结果47-49
• 5 讨论49-51
• 6 结论51
• 7 参考文献51-53
• 附录53-54
• 本人简历53
• 学习和工作经历53
• 在学期间的研究成果目录53-54
• 致谢54-56
• 课题综述56-63
• 参考文献61-63

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本文编号：365148