蛋白4.1R对小鼠黑色素瘤PDT效应的影响

发布时间：2022-11-04 18:22

　　研究背景黑色素瘤是皮肤癌最具侵袭性的恶性肿瘤,占皮肤肿瘤死亡率的80%。目前,黑色素瘤治疗的常用方法包括手术切除、化疗和放疗。然而,由于其耐药性和转移性,黑色素瘤患者的长期生存率并不理想,亟待寻求新的黑色素瘤治疗靶点和治疗策略。光动力疗法（PDT）因其对肿瘤组织的高选择性、对正常组织的毒副作用小及良好的美容效果,是目前继传统治疗方法之后的一种新的皮肤肿瘤的治疗手段。近年来,随着对PDT作用机制更深入的研究,认为PDT在诱导细胞凋亡方面效果显著,并且能够引发抗肿瘤免疫作用,可以预见,PDT将成为治疗黑色素瘤的一种全新疗法。尽管PDT抗肿瘤作用机制研究取得一定进展,但许多参与这一复杂过程的分子还未被发现,确切的作用机制还没有被完全阐明。因此,发现调控PDT抗肿瘤效应的新分子对于加深人们对PDT作用机制的认识和改进临床疗效具有重要的意义。蛋白4.1R最初是在人成熟红细胞中被发现的80KD细胞膜骨架蛋白分子,可以将跨膜蛋白与血影蛋白-肌动蛋白连接起来,对细胞正常形态结构的维持、细胞分裂、信号转导等功能发挥重要的作用。课题组前期研究,发现蛋白4.1R通过抑制CD8⁺T淋巴细... 

【文章页数】：86 页

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摘要
Abstract
常见英文缩略一览表
第一章 引言
    1.1 黑色素瘤
    1.2 光动力疗法
    1.3 5-ALA-PDT
    1.4 蛋白4.1R
    1.5 研究目的与意义
    1.6 技术路线
第二章 运用CRISPR/Cas9系统构建敲除蛋白4.1R基因的B16细胞株
    2.1 材料
        2.1.1 细胞株
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 常用试剂配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 细胞培养
        2.2.2 检测蛋白4.1R在B16细胞中的表达
        2.2.3 sgRNA的设计及寡核苷酸链的合成
        2.2.4 重组质粒LentiCRISPRv2-sgRNA的构建
        2.2.5 慢病毒的包装
        2.2.6 慢病毒感染B16细胞
        2.2.7 有限稀释法筛选单克隆
        2.2.8 免疫印迹法检测细胞株内4.1R蛋白表达
        2.2.9 细胞克隆鉴定
    2.3 结果
        2.3.1 4.1R基因在B16细胞中的表达
        2.3.2 LentiCRISPRv2-sgRNA载体的构建
        2.3.3 单克隆筛选结果
        2.3.4 免疫印迹法检测单克隆细胞株内4.1R表达
        2.3.5 测序验证蛋白4.1R敲除效果
    2.4 讨论
第三章 蛋白4.1R对B16细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响
    3.1 材料
        3.1.1 细胞株
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 细胞培养
        3.2.2 CCK-8 法检测蛋白4.1R基因敲除对B16细胞增殖的影响
        3.2.3 划痕实验检测蛋白4.1R基因敲除对B16细胞迁移能力的影响
        3.2.4 Transwell检测蛋白4.1R基因敲除对B16细胞侵袭能力的影响
        3.2.5 统计分析
    3.3 结果
        3.3.1 蛋白4.1R基因敲除促进B16细胞的增殖能力
        3.3.2 蛋白4.1R基因敲除促进B16细胞迁移能力
        3.3.3 蛋白4.1R基因敲除促进B16细胞侵袭能力
    3.4 讨论
第四章 蛋白4.1R基因敲除对B16细胞PDT敏感性的影响
    4.1 材料
        4.1.1 细胞株
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要仪器
        4.1.4 主要试剂配制
    4.2 实验方法
        4.2.1 细胞培养
        4.2.2 5-ALA最佳孵育浓度与时间确定
        4.2.3 蛋白4.1R敲除对B16细胞PDT敏感性的影响
        4.2.4 蛋白4.1R基因敲除对B16细胞内PpIX积累量的影响
        4.2.5 蛋白4.1R基因敲除对PDT后B16细胞ROS含量的影响
        4.2.6 蛋白4.1R基因敲除对PDT后B16细胞凋亡的影响
        4.2.7 统计分析
    4.3 结果
        4.3.1 5-ALA最佳孵育浓度与时间确定
        4.3.2 蛋白4.1R基因敲除降低B16细胞对PDT的敏感性
        4.3.3 蛋白4.1R基因敲除对B16细胞内PpⅨ积累量的影响
        4.3.4 蛋白4.1R基因敲除对PDT后B16细胞内ROS含量的影响
        4.3.5 蛋白4.1R基因敲除对PDT后B16细胞凋亡的影响
    4.4 讨论
第五章 蛋白4.1R影响B16细胞PDT敏感性的机制探索
    5.1 材料
        5.1.1 细胞株
        5.1.2 主要试剂
        5.1.3 主要仪器
    5.2 实验方法
        5.2.1 qRT-PCR法检测B16-4.1R~(+/+)和B16-4.1R~(-/-)细胞内GAT-1、GAT-2mRNA的表达情况
        5.2.2 Westernblot法检测GAT-1和GAT-2在B16-4.1R~(+/+)和B16-4.1R~(-/-)细胞内的表达情况
        5.2.3 免疫荧光法检测GAT-1、GAT-2与蛋白4.1R定位情况
        5.2.4 免疫共沉淀法检测GAT-1、GAT-2与蛋白4.1R的相互作用
        5.2.5 统计分析
    5.3 结果
        5.3.1 B16-4.1R~(+/+)和B16-4.1R~(-/-)细胞内GAT-1、GAT-2基因表达情况
        5.3.2 B16-4.1R~(+/+)和B16-4.1R~(-/-)细胞内GAT-1和GAT-2蛋白表达情况
        5.3.3 GAT-1、GAT-2在B16细胞中与蛋白4.1R共定位
        5.3.4 GAT-1、GAT-2在B16细胞中与蛋白4.1R存在相互作用
    5.4 讨论
第六章 蛋白4.1R对B16细胞体内光动力效应的影响
    6.1 材料
        6.1.1 实验动物
        6.1.2 细胞株
        6.1.3 主要试剂
        6.1.4 主要仪器
        6.1.5 主要试剂配制
    6.2 实验方法
        6.2.1 小鼠皮下移植瘤模型建立
        6.2.2 PDT处理方案
        6.2.3 肿瘤组织石蜡包埋、切片与H&E染色
        6.2.4 荧光定量PCR检测肿瘤组织中细胞因子mRNA的表达
        6.2.5 ELISA法检测细胞因子的表达
        6.2.6 肿瘤组织CD8+T淋巴细胞免疫组化
        6.2.7 统计分析
    6.3 结果
        6.3.1 蛋白4.1R基因敲除下调PDT对肿瘤的杀伤效果
        6.3.2 荧光定量PCR法检测肿瘤组织中细胞因子mRNA的表达情况
        6.3.3 ELISA法检测细胞因子的表达
        6.3.4 肿瘤组织CD8+T淋巴细胞免疫组化结果
    6.4 讨论
全文讨论与总结
参考文献
个人简历、在学期间发表的学术论文及成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的研究进展[J]. 郑小梅,张晓立,于建东,郑平,孙际宾.  生物技术进展. 2015(01)
[2]食管小细胞癌组织中4.1蛋白家族的表达及意义[J]. 高艳锋,祁元明,宋英,翟明霞,陈鲤翔.  山东医药. 2008(15)
[3]细胞骨架4．1蛋白基因家族在结直肠癌组织中的表达[J]. 冯文坡,陈鲤翔,寇晓丹,许晶晶,康巧珍,祁元明.  世界华人消化杂志. 2007(22)



本文编号：3701105