分子佐剂GM-CSF、MIP-1α和黑素瘤DNA疫苗的构建及鉴定

发布时间：2024-02-23 18:13

　　目的: 恶性黑素瘤(简称黑素瘤),是来源于黑素细胞的恶性肿瘤。由于包括TRP2在内的多种黑素瘤相关抗原的不断发现,以及部分黑素瘤患者中发现肿瘤自发消退现象表明机体免疫系统能够清除肿瘤细胞,该肿瘤已被作为肿瘤免疫治疗的模式疾病。然而,TRP2等黑素瘤相关抗原的免疫原性低,肿瘤疫苗的疗效甚微。本研究旨在构建基于GM-CSF和MIP-1α的真核表达载体作为分子佐剂,建立基于TRP2的黑素瘤DNA疫苗,并在多种系统中进行验证,从而为进一步探索黑素瘤等相关肿瘤的免疫治疗打下基础。 方法: 利用RT-PCR法从小鼠脾脏总RNA中分别扩增小鼠GM-CSF和MIP-1α基因的cDNA,并将其与载体pVAX1连接,构建相应的真核表达载体。同时,以RT-PCR法从B16F10总RNA中扩增小鼠TRP2基因的cDNA,并将其与载体pEGFP-N1连接,构建其真核表达载体。所有载体经测序验证正确。将重组质粒分别转染到HeLa细胞中,ELISA方法鉴定GM-CSF的表达,骨髓细胞集落形成法测定其生物活性;TRP2的表达以免疫印迹法鉴定,并以激光共聚焦显微镜观察其在HeLa细胞中的表达及亚细胞定位;通过冰冻切片和...

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
一、前言
    1 DNA疫苗
    2 分子佐剂
    3 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子
    4 巨噬细胞炎症蛋白-1α
    5 黑素瘤肿瘤抗原酪氨酸相关蛋白2
    6 本课题的研究目的和意义
    7 本课题的技术路线
二、实验材料与设备
    1 主要仪器和设备
    2 主要试剂和材料
    3 本实验中所用主要试剂配制方法见附录Ⅰ
三、实验方法与步骤
    1 C57BL/6小鼠脾脏总RNA抽提及cDNA合成
    2 小鼠GM-CSF基因的真核表达载体的构建与序列分析
    3 小鼠GM-CSF重组质粒的真核表达
    4 小鼠GM-CSF重组质粒真核表达产物活性测定
    5 小鼠GM-CSF和MIP-1α重组质粒体内表达分析
    6 小鼠MIP-1α基因的真核表达载体的构建与序列分析
    7 小鼠MIP-1α重组质粒的真核表达
    8 C57BL/6小鼠黑素瘤总RNA抽提及cDNA合成
    9 小鼠TRP2基因的真核表达载体的构建与序列分析
    10 小鼠TRP2重组质粒的真核表达
    11 小鼠TRP2重组质粒真核表达产物的鉴定
    12 小鼠TRP2重组质粒真核表达产物的亚细胞定位
    13 小鼠GM-CSF、MIP-1α和TRP2重组质粒大规模制备
四、实验结果
    1 小鼠GM-CSF全长基因cDNA真核表达载体的构建及序列分析
    2 小鼠GM-CSF重组质粒真核表达产物的含量测定
    3 小鼠GM-CSF重组质粒真核表达产物活性分析
    4 小鼠GM-CSF重组质粒体内表达
    5 小鼠MIP-1α全长基因cDNA真核表达载体的构建与序列分析
    6 小鼠MIP-1α重组质粒体内表达
    7 小鼠TRP2全长基因cDNA真核表达载体的构建与序列分析
    8 小鼠TRP2全长基因cDNA真核表达产物的WESTERN BLOT鉴定
    9 小鼠TRP2重组质粒真核表达产物的亚细胞定位
五、讨论
    1 分子佐剂GM-CSF和MIP-lα
    2 黑素瘤DNA疫苗
六、结论
REFERENCES(参考文献)
附录Ⅰ 本实验中所用主要试剂配制方法
附录Ⅱ 英文缩略词
附录Ⅲ 在校期间发表及参与研究论文情况
致谢



本文编号：3907763