靶向Neuropilin-1单克隆抗体对皮肤癌细胞生长抑制作用及其机制的研究

发布时间：2017-06-03 10:06

  本文关键词：靶向Neuropilin-1单克隆抗体对皮肤癌细胞生长抑制作用及其机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景和目的 在日照丰富的国家,皮肤癌的患病率极高,其病因复杂,发病机制各异,而传统的放疗、化疗手段存在抗肿瘤效果差、副作用大等一系列缺点。分子靶向治疗却有着良好的肿瘤靶向性和较低的毒副作用,为癌症治疗提供了新的治疗手段。近期研究显示神经鞭毛素蛋白-1(Neuropilin-1, NRP-1)是癌症治疗的新靶标,NRP-1是一个新型的多功能受体,是I型跨膜糖蛋白。NRP-1可作为轴突导向因子3(semaphorin3, Sema3)、血管内皮细胞因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)等多种细胞因子的共受体,参与调控多种细胞因子介导的经典信号通路,同时其本身也具有独立的信号通路,与肿瘤血管新生及肿瘤的发生发展密切相关。许多实验证明NRP-1在皮肤癌上有较高的表达,并与其发生发展密切相关,但作用机制尚不清楚。本文旨在检测本实验室制各的抗NRP-1单克隆抗体(NRP-1mAb)对皮肤癌细胞株生存的影响,并探讨其作用机制,为发展一种以NRP-1为靶标的新型抗肿瘤策略奠定基础。 实验方法 利用Balb/c鼠生产NRP-1mAb; rProtein A柱纯化抗体；SDS-PAGE蛋白电泳检测抗体的纯度和浓度；间接ELISA鉴定抗体活性；流式细胞术、Western blotting、细胞免疫荧光及免疫组化检测NRP-1mAb的特异性及NRP-1蛋白在皮肤癌细胞株和皮肤癌组织上的表达情况；光镜观察NRP-1mAb对细胞形态的影响；细胞抑制实验(MTT)和集落形成抑制试验检测NRP-1mAb对皮肤癌细胞株增殖的影响；流式细胞术和细胞核荧光染色检测NRP-1mAb对皮肤癌细胞株凋亡的影响；Western blotting检测凋亡相关蛋白(Caspase-3、Bax、Bcl-2)和增殖相关蛋白(PI3K、p-Akt、Akt、p-ERK1/2、ERK1/2)的表达,分析NRP-1mAb对PI3K/Akt和MEK/ERK信号通路的激活情况,探讨NRP-1mAb对皮肤癌细胞的作用机制。 实验结果 制备纯化的NRP-1mAb纯度高达96.5%,效价约为1×10-6,同时不同批次效价类似,表明其活性稳定。NRP-1mAb与NRP-1blb2蛋白、B16F10细胞和A431细胞分别在39KDa、100KDa和130KDa处均有特异性的结合带。两株皮肤癌细胞株及皮肤癌组织上NRP-1抗原表达呈阳性,主要定位于细胞膜上,且A431表达更高；MTT结果显示NRP-1mAb能抑制皮肤癌细胞株A431和B16F10的增殖,且抑制作用与剂量和时间正相关。细胞集落形成抑制实验结果表明,不同浓度抗体均可显著抑制细胞集落的形成,并呈剂量依赖性。细胞核Hoechst33258荧光染色、流式细胞术结果表明NRP-1mAb可诱导皮肤癌细胞凋亡,并呈剂量依赖性。Western blotting检测到NRP-1mAb作用皮肤癌细胞后Bax表达上调、Caspase-3的剪切带增加,Bcl-2、PI3K(85)、p-Akt、p-ERK1/2表达下调。 结论 1.本课题成功制备了高纯度、高效价且效价稳定的NRP-1mAb。 2.NRP-1mAb能特异性的结合皮肤癌细胞上NRP-1蛋白,且皮肤癌细胞及皮肤癌组织上高表达NRP-1。 3.NRP-1mAb能显著抑制皮肤癌细胞的生长并呈时效、量效关系。 4.NRP-1mAb对皮肤癌细胞的生长抑制作用与下调PI3K/Akt和MEK/ERK信号通路相关。
【关键词】：Neuropilin-1 单克隆抗体 皮肤癌 增殖 凋亡
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-16
• 前言16-32
• 一、皮肤癌概述16-19
• 1 皮肤癌的发病原因及发病机制16-18
• 1.1 皮肤癌的发病原因16-17
• 1.2 皮肤癌的发病机制17-18
• 2 皮肤癌的治疗18-19
• 二、Neuropilin-1概述19-29
• 1 NRP-1的结构及其异构体19-21
• 2 NRP-1的表达21-22
• 3 NRP-1的配体与共受体22-26
• 3.1 Plexin和semaphorin23
• 3.2 VEGF和VEGFR23-24
• 3.3 TGF-p和TGFR24
• 3.4 FGF、HGF和c-Met24
• 3.5 PDGF和PDGFR24-25
• 3.6 EGF和EFGR25
• 3.7 Fibronectin和Integrin25-26
• 4 NRP-1的功能26-29
• 4.1 NRP-1与血管生成26-27
• 4.2 NRP-1与神经发育27-28
• 4.3 NRP-1与肿瘤的发生发展28
• 4.4 NRP-1与免疫调节28-29
• 5 靶向NRP-1的药物29
• 三、NRP-1在皮肤癌中研究进展29-30
• 四、研究目的和内容30-32
• 第一章 NRP-1 mAb的制备、纯化及鉴定32-44
• 一、材料和方法32-41
• 1 材料32-37
• 1.1 细胞株和实验动物32
• 1.2 主要试剂及耗材32-33
• 1.3 主要仪器及设备33
• 1.4 主要溶液的配制33-37
• 2 方法37-41
• 2.1 杂交瘤细胞培养37-38
• 2.2 抗体的生产38
• 2.3 抗体的纯化38-39
• 2.4 抗体的透析和冻干39
• 2.5 抗体的纯度鉴定39-40
• 2.6 抗体的浓度测定40
• 2.7 抗体的滴度鉴定40-41
• 二、结果与分析41-43
• 1 纯度测定41-42
• 2 滴度测定42-43
• 三、讨论43-44
• 第二章 NRP-1在皮肤癌细胞株及皮肤癌组织中的表达44-54
• 一、材料和方法44-49
• 1 材料44-45
• 1.1 细胞株44
• 1.2 主要试剂及耗材44
• 1.3 主要仪器及设备44-45
• 1.4 主要溶液的配制45
• 2 方法45-49
• 2.1 流式细胞术45-46
• 2.2 Western blotting46-47
• 2.3 细胞免疫荧光染色47-48
• 2.4 免疫组织化学染色48-49
• 二、结果与分析49-53
• 1 流式细胞术49-50
• 2 Western blotting50
• 3 细胞免疫荧光染色50-51
• 4 免疫组织化学染色51-53
• 三、讨论53-54
• 第三章 NRP-1 mAb对皮肤癌细胞的生长抑制作用54-67
• 一、材料和方法54-58
• 1 材料54-55
• 1.1 细胞株54
• 1.2 主要试剂及耗材54
• 1.3 主要仪器及设备54-55
• 1.4 主要溶液的配制55
• 2 方法55-58
• 2.1 细胞计数55-56
• 2.2 细胞生长抑制试验56
• 2.3 集落形成抑制实验56-57
• 2.4 流式细胞术检测细胞凋亡57
• 2.5 荧光显微镜法观察细胞凋亡57-58
• 2.6 统计学处理58
• 二、结果与分析58-65
• 1 抗NRP-1抗体抑制细胞增殖58-63
• 1.1 普通显微镜法观察细胞形态变化58-60
• 1.2 MTT法60-62
• 1.3 集落形成抑制实验62-63
• 2 抗NRP-1抗体促进细胞凋亡63-65
• 2.1 流式细胞术检测细胞凋亡63-65
• 2.2 荧光显微镜法观察细胞凋亡65
• 三、讨论65-67
• 第四章 NRP-1 mAb对皮肤癌细胞生长抑制作用机制67-75
• 一、材料和方法67-68
• 1 材料67-68
• 1.1 细胞株67
• 1.2 主要试剂及耗材67
• 1.3 主要仪器及设备67
• 1.4 主要溶液的配制67-68
• 2 方法68
• 二、结果与分析68-71
• 1 凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2的表达68-70
• 2 增殖相关蛋白PI3K(85)、p-Akt和p-ERK1/2的表达70-71
• 三、讨论71-75
• 结论75-76
• 本文存在的问题及今后应开展的研究76-77
• 参考文献77-91
• 致谢91-92
• 研究生在学期间发表的主要学术论文目录92

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1 吕莎;靶向Neuropilin-1单克隆抗体对皮肤癌细胞生长抑制作用及其机制的研究[D];厦门大学;2014年

2 马红樱;荒漠藻胞外聚合物抗肿瘤活性及其机理研究[D];西北师范大学;2005年

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本文编号：417850