促进毛乳头细胞体外增殖的新方法：P21的基因沉默

发布时间：2017-07-16 12:32

  本文关键词：促进毛乳头细胞体外增殖的新方法：P21的基因沉默

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【摘要】：目的：毛囊是一种哺乳动物特有的结构复杂的皮肤附属器官，富含干细胞，由神经外胚层和中胚层交互作用形成的一个典型再生系统，它能诱导毛干和毛纤维的产生，其主要包含来源于间充质的毛乳头细胞(Dermalpapilla cells, DPCs)及真皮鞘细胞。毛乳头细胞位于毛囊基地部，体内外诱导毛囊形成及促进毛发生长是其最重要的生物学特性，并在毛囊的发生、发展和周期性循环中起主导作用，且体内外诱导毛囊形成及促进毛发生长是DPCs最重要的生物学功能。但是研究表明只有早期DPCs具有毛囊诱导能力，晚期DPCs细胞则失去这种功能。体外培养早期DPCs展现出凝集性生长特性，但随着传代次数不断增加，细胞逐渐衰老，这一特性也逐渐丧失。因此，研究者认为DPCs凝集性生长特性可能与其诱导毛囊形成的生物学功能有关。目前对于体外培养的DPCs逐渐丧失凝集性生长特性及生物学功能的原因及机制尚不清楚，值得进一步研究。细胞衰老即细胞过于老化时，可抑制细胞分裂并导致细胞自然死亡过程。研究认为P21(即CDKN1A)作为细胞周期蛋白激酶的广谱抑制因子能够诱导细胞老化的多效性调节剂-酰胺酶，并影响细胞衰老的许多过程，是细胞衰老过程中的关键基因。本实验通过腺病毒感染DPCs来沉默P21基因，并检测细胞的形态、增殖、周期及凋亡等变化情况，以研究P21在DPCs中的表达及其作用，并探索P21与其生物学功能是否有相关性。 方法： 1实验分组： 正常组：常规传代培养。 阴性对照组：用腺病毒HK-1p2shRNA，即空载体腺病毒感染DPCs，以排除空载体腺病毒本身的干扰。 阳性对照组：用腺病毒CDKN1A-1p2shRNA，即沉默P21基因的腺病毒感染DPCs。 2毛乳头细胞的培养及腺病素转染。将三组毛乳头细胞一同培养于MSCM培养基中，置于温箱内常规培养。并应用荧光显微镜检测腺病毒转染效率。 3对比三组毛乳头细胞的形态改变及生物学功能。 4应用扫描电镜观察细胞形态。 5应用MTT的方法绘制细胞的生长曲线。 6应用流式细胞术检测细胞的细胞周期及凋亡。 7应用流式细胞术、免疫组化及免疫荧光三种方法检测P21蛋白在细胞中的表达情况。 8应用反转录PCR及实时荧光定量PCR的方法检测细胞中P21基因mRNA的表达情况。 9应用SPSS16.0，以α=0.05的检验标准对数据进行统计分析及处理。 结果: 1体外成功培养人毛乳头细胞至13代，人毛乳头细胞腺病毒转染HK-1p2shRNA和CDKN1A-1p2shRNA的转染效率达到80-90%。 2正常组：低代次细胞展现明显的凝集性生长特性，8代开始消失，随着传代次数增加，细胞体积变大，形态变不规则，胞质颗粒增多；同代次阴性对照组细胞凝集性生长特性及细胞形态无明显变化；同代次阳性对照组细胞凝集性生长恶性无明显变化，但细胞体积稍变大，胞质颗粒增多。 3扫描电镜中阳性对照组细胞的细胞核核分叶增多，核颗粒增多。 4MTT法绘制三种毛乳头细胞的生长曲线显示:正常组中4、7、10及12代细胞生长速度依次减慢，而同代次阳性对照组细胞较正常组细胞生长速度增快。 5流式细胞术检测毛乳头细胞的细胞周期及凋亡。 细胞G1期比例用百分比表示，细胞凋亡用%Gated值表示。流式结果显示：正常组4代、7代及10代毛乳头细胞G1期比例分别为：39.7667%±6.7575%、53.9667%±3.0271%及61.4667%±0.6028%，，细胞凋亡率分别为：2.12±0.4232、5.6433±1.3503及10.54±2.1345；而5代正常组、阴性对照组及阳性对照组细胞的G1期比例分别为：47.9333%±9.7285%、51.7%±7.494%及40.1%±6.3095%，凋亡率分别是：3.3767±0.8769、7.3567±0.4387及12.3233±1.769；8代正常组、阴性对照组及阳性对照组细胞的G1期比例分别为:55.5333%±1.9858%、58.8667%±4.6801%及44.9667%±7.9689%，凋亡率分别是：9.4067±0.9463、13.6967±0.8838及17.9567±3.2875。 6流失细胞术检测毛乳头细胞P21蛋白的表达量用荧光指数（FI）表示，流式结果示：正常组4、7、10代毛乳头细胞中P21蛋白的FI值分别为：2.0825±0.1923、2.4945±0.135、2.8298±0.071；5代正常组、阴性对照组及阳性对照组细胞中P21蛋白的FI值分别为：2.2546±0.0363、2.35±0.127及2.0278±0.1443；8代正常组、阴性对照组及阳性对照组细胞中P21蛋白的FI值分别为：2.5947±0.1184、2.683±0.1984及2.4019±0.1048。 免疫组化的结果显示P21蛋白定位于毛乳头细胞的细胞核及细胞质，而阳性对照组毛乳头细胞P21蛋白定位于细胞核及核周围区域。 免疫荧光的结果显示正常组10代毛乳头细胞胞质内P21蛋白表达量明显多于4代及7代细胞。 7反转录PCR结果显示阳性对照组毛乳头细胞的P21基因mRNA表达降低；实时荧光定量PCR结果示：正常组4、7、10代毛乳头细胞P21基因mRNA表达量分别为：1、4.8787±0.8342及33.2018±2,536；5代正常组、阴性对照组及阳性对照组细胞中P21基因mRNA表达量分别为：1、2.7617±0.9544及0.0609±0.0342；8代正常组、阴性对照组及阳性对照组细胞中P21基因mRNA表达量分别为:1、9.3697±4.9706及0.0640±0.0305。 结论： 1P21可参与调节毛乳头细胞的衰老过程。 2P21可抑制毛乳头细胞增殖，从而引起毛乳头细胞生长阻滞。 3P21可引起毛乳头细胞细胞周期阻滞，抑制毛乳头细胞由G1向S期过渡。 4P21可抑制毛乳头细胞的细胞凋亡。 5沉默P21基因有可能作为促进毛乳头细胞增殖的新方法。
【关键词】：毛乳头 P21 毛囊 病毒转染 基因沉默
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R758.7
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11-12
• 材料和方法12-21
• 结果21-26
• 附图26-33
• 附表33-36
• 讨论36-41
• 结论41-42
• 参考文献42-47
• 综述 毛乳头细胞的研究进展47-64
• 参考文献55-64
• 致谢64-65
• 个人简历65

【参考文献】

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1 王继文,宋志强,杨希川,麦跃,郝飞;毛乳头细胞凝聚性生长差异表达基因的筛选及HSPC016全长克隆的生物信息学分析[J];中华医学杂志;2004年18期

本文编号：548719