靶向黑色素瘤重组免疫毒素MSH-PE38KDEL的表达、纯化及其靶向抗肿瘤生物学效应

发布时间：2017-07-17 09:02

  本文关键词：靶向黑色素瘤重组免疫毒素MSH-PE38KDEL的表达、纯化及其靶向抗肿瘤生物学效应

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【摘要】：恶性黑色素瘤是恶性肿瘤中发病率增长最快的一种，目前仍没有找到治疗转移性黑色素瘤最为有效的方法。重组毒素由于具有特异性高、细胞毒性强的特点，有望成为黑色素瘤（辅助）治疗的有效方法之一，特别是对转移性黑色素瘤的治疗可能是最好的方式。本研究利用恶性黑色素瘤细胞表面MC1R的结合位点为正常细胞及其它肿瘤的几十倍的巨大差异，并利用促黑色素细胞激素(Melanophore-stimulating hormone, α-MSH)可特异性的与恶性黑色素瘤表面的MC1R结合的特性，将α-MSH作为恶性黑色素瘤特异的靶向载体；将绿脓杆菌外毒素PE作为免疫毒素的毒性部分用于杀伤靶细胞，构建了重组毒素MSH-PE38KDEL，以基因工程方式表达黑色素瘤靶向免疫毒素。 重组毒素MSH-PE38KDEL的构建与表达。本研究通过生物信息学分析，优化MSH与PE40的链接Linker，确保各自的结构与功能不受影响；然后对PE40进行修饰，降低其免疫原性（PE38），并增加其活性（PE38KDEL）；构建了MSH-PE38KDEL基因，将其连接到pET28a、pHis1525表达载体上，构建了pET28a-MSH-PE38KDEL、 pHis1525-MSH-PE38KDEL重组质粒，分别在Rosegami、WH320表达宿主菌内进行了表达，经SDS-PAGE分析及活性测定，最终筛选了高表达且具有生物活性的重组质粒pET28a-MSH-PE38KDEL。将序列鉴定正确的重组质粒转化入Rosetta-gamiTM2(DE3)，IPTG诱导目的蛋白表达。以SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。同时用凝胶成像分析系统配套软件对MSH-PE38KDEL融合蛋白的表达量进行分析，证明其表达量可占全菌体的10%。 重组毒素MSH-PE38KDEL的纯化。利用Western blot对超声破碎后菌体进行分析证明融合蛋白为可溶性表达。对表达后蛋白采用了菌体超声破碎、离心、疏水层析、离子交换及分子筛层析等纯化手段， SDS-PAGE分析MSH-PE38KDEL的纯度，，其纯度可达90%以上。 重组毒素MSH-PE38KDEL的体外抗黑色素瘤活性。采用α-MSH受体高表达的人黑色素瘤A875细胞及鼠黑色素瘤B16细胞进行了体外生物活性试验，同时以α-MSH受体低表达的鼻咽癌细胞CNE、乳腺癌细胞MCF及人正常细胞2BS做对照，证明其靶向杀伤作用。MTT检测MSH-PE38KDEL对黑色素瘤细胞A875及B16的杀伤作用在85%以上，而对人正常细胞2BS无杀伤作用。 重组毒素MSH-PE38KDEL的体内抗黑色素瘤活性。以鼠黑色素瘤B16细胞在NIH/nu裸鼠体内建立黑色素瘤高转移动物模型。采用了瘤周围注射及静脉注射两种给药途径，对荷瘤小鼠进行治疗。结果显示以MSH-PE38KDEL1.1mg/只连续注射10天，可显著抑制肿瘤生长，其抑瘤率＞90%，且瘤周注射组肿瘤消失率为30%，静脉注射组肿瘤消失率为40%。病理切片HE染色结果显示MSH-PE38KDEL有效抑制了黑色素瘤B16细胞的肝内转移；电镜观察肝脏超微结构结果显示，MSH-PE38KDEL抑制了黑色素瘤B16细胞对机体细胞的破坏作用。重组毒素MSH-PE38KDEL在体内具有明显的抗黑色素瘤的效应，毒副作用低，病理及电镜结果显示对实质脏器均未见损伤。MSH-PE38KDEL有望成为靶向治疗黑色素瘤的候选药物。
【关键词】：重组免疫毒素 MSH-PE38KDEL 黑色素瘤 靶向治疗
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文缩略词表11-13
• 第一篇 文献综述13-45
• 第1章 黑色素瘤研究进展13-19
• 1.1 我国黑色素瘤发生情况13-14
• 1.2 恶性黑色素瘤的转移途径及发生机制14-15
• 1.3 黑色素瘤的治疗15-17
• 1.4 免疫毒素用于黑色素瘤治疗的展望17-19
• 第2章 免疫毒素的研究进展19-29
• 2.1 免疫毒素的概念及策略19-20
• 2.2 免疫毒素的研究历程20-22
• 2.3 重组免疫毒素靶向分子的选择22-24
• 2.4 重组免疫毒素毒素配体的设计及作用机制24-25
• 2.5 重组免疫毒素在肿瘤治疗中的研究25-27
• 2.6 重组免疫毒素治疗实体瘤的研究进展27-28
• 2.7 重组免疫毒素研发及应用的瓶颈28-29
• 第3章 PE 类重组免疫毒素的研究进展29-37
• 3.1 PE 的结构与功能29-30
• 3.2 PE 的细胞毒性机制30-31
• 3.3 PE 衍生物31-32
• 3.4 PE 衍生物基因重组免疫毒素的研究进展32-34
• 3.5 PE 类毒素在肿瘤导向中的应用34-37
• 第4章 促黑色素细胞激素及其受体研究进展37-45
• 4.1 促黑色素细胞激素及其受体37-40
• 4.2 以促黑色素细胞激素为靶向载体的重组毒素的研究进展40
• 4.3 促黑色素细胞激素及其受体在人类疾病中的作用40-43
• 4.4 促黑色素细胞激素为导向的研究策略43-45
• 第二篇 研究内容45-145
• 第1章 MSH-PE38KDEL 在巨大芽孢杆菌中的表达及活性测定45-67
• 1.1 材料与方法46-58
• 1.2 结果58-62
• 1.3 讨论62-65
• 1.4 小结65-67
• 第2章 MSH-PE38KDEL 在大肠杆菌中的表达及活性测定67-81
• 2.1 材料与方法67-74
• 2.2 结果74-78
• 2.3 讨论78-79
• 2.4 小结79-81
• 第3章 MSH-PE38KDEL 的表达、纯化及鉴定81-95
• 3.1 材料与方法81-87
• 3.2 结果87-91
• 3.3 讨论91-93
• 3.4 小结93-95
• 第4章 MSH-PE38KDEL 对黑色素瘤细胞生长的抑制作用95-109
• 4.1 材料与方法95-98
• 4.2 结果98-104
• 4.3 讨论104-107
• 4.4 小结107-109
• 第5章 MSH-PE38KDEL 对鼠黑色素瘤模型的治疗试验109-145
• 5.1 材料与方法109-115
• 5.2 结果115-140
• 5.3 讨论140-144
• 5.4 小结144-145
• 结论145-147
• 参考文献147-167
• 导师简介167-169
• 作者简介169-171
• 攻读学位期间发表的学术论文及取得的成果171-173
• 致谢173

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：552819