调节性B细胞与自身免疫性疱病的相关性研究

发布时间：2017-07-20 22:24

  本文关键词：调节性B细胞与自身免疫性疱病的相关性研究

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【摘要】：自身免疫性疱病（autoimmune bullous diseases, AIBDs）是一组临床表现为红斑、糜烂、水疱、大疱的自身免疫性疾病，病情多顽固且易反复发作[1,2]。目前认为该类疾病的发病主要是由致病性抗体与抗原结合并激活一系列的免疫炎症反应导致表皮间或者真皮基底膜带的不同粘附分子被破坏而致病。大疱性类天疱疮（bullouspemphigoid，BP）和寻常型天疱疮（pemphigus vulgaris，PV）是最为常见的靶抗原明确的自身免疫性疱病[3-5]。PV中自身反应性B细胞和CD4~+T细胞识别的主要靶抗原为桥粒芯糖蛋白1（Dsg1）和桥粒芯糖蛋白3（Dsg3），BP中主要靶抗原为大疱性类天疱疮抗原1和抗原2，即BPAG1（BP230）和BPAG2（BP180），目前认为BP180是BP主要的致病性抗原，其胞外端的第16位非胶原编码区（NC16A）区域是主要的致病性靶表位区[6-9]。 近年来的研究证实致病性自身抗体的产生是自身免疫性疱病的关键致病因素[10]。但是自身抗体是如何产生的，以及免疫调节细胞如调节性B细胞(regulatory Bcells, Breg)、调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)以及体液免疫中辅助B细胞产生抗体的滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells，，Tfh）在自身免疫性疱病发病中的作用目前均不清楚。 B细胞是否像T细胞一样存在多种不同调节功能的细胞亚群是目前免疫学研究的热点，并于近年取得了很多重要的研究发现。目前已经明确并得到公认在小鼠体内存在一群主要通过分泌白介素10(IL-10)而发挥负向免疫调节作用的为数较少的Breg亚群，其表面标记为CD19~+CD5~+CD1dhi，并且在多种疾病包括I型糖尿病、接触性超敏反应、胶原诱导的关节炎等动物模型中证实了其对免疫炎症反应的抑制作用[11-13]。2011年美国杜克大学的一个研究小组证实了类似小鼠调节性B细胞的人调节性B细胞亚群的存在，其主要的表面标记为CD19~+CD24~(hi)CD27~+,并发现该细胞亚群与多种自身免疫性疾病有着密切的联系[14]。Breg细胞与自身免疫性疱病的关系如何？Breg细胞对致病性自身抗体的产生有什么样的影响？本课题通过检测寻常型天疱疮和大疱性类天疱疮患者外周血中Breg细胞水平，研究Breg细胞与AIBDs发病的相关性，通过观察Breg细胞对大疱性类天疱疮抗体产生的影响，初步探讨Breg细胞参与AIBDs发病过程中抗体产生的机制，从而深化对AIBDs发病机理的认识，为其治疗提供新的思路。 目的：明确Breg细胞与PV和BP两种疾病的相关性，确定BP患者外周血Breg细胞的负向免疫调节功能，观察Breg细胞对大疱性类天疱疮致病性自身抗体产生的影响，探讨其在AIBDs发病中的重要作用。 方法： 1)收集PV和BP患者及健康对照者外周血，分离提取获得相应的血清、PBMC以及RNA； 2)利用流式细胞术观察患者PBMC中Breg细胞水平的变化； 3)利用Realtime-PCR和Elisa方法分析患者及健康对照者的外周血中IL-10的表达水平； 4)利用磁珠分选及流式细胞术分选健康人以及BP患者外周血的Breg细胞（CD19~+CD24~(hi)CD27~+）和效应T细胞（CD4~+CD25-）；通过构建细胞共孵育模型，研究Breg细胞对效应T细胞的负向免疫调节功能； 5)原核表达BP自身抗原BP180-NC16A，以该抗原刺激BP患者PBMC，通过检测培养上清中致病性抗体水平的变化，比较Breg细胞是否影响致病性抗体的产生。 结果：自身免疫性疱病PV、BP患者外周血中Breg细胞水平明显高于健康对照组。患者外周血中IL-10在蛋白水平及RNA水平与健康对照组相比没有显著差异。健康人外周血中Breg细胞能够明显抑制CD4~+T细胞IFN-γ、TNF-α以及IL-4的产生和CD4~+T细胞的增殖，而来自BP患者的Breg细胞对CD4~+T细胞IFN-γ、TNF-α、IL-4的产生以及CD4~+T细胞增殖的抑制作用存在缺陷。来自BP患者的B细胞对BP180-NC16A抗原具有抗原特异性反应，其分泌的致病性抗体水平明显升高；而清除Breg细胞亚群（CD19~+CD24~(hi)CD27~+）后进行BP180-NC16A抗原刺激培养，发现在无Breg细胞情况下抗体产生水平未受明显影响。 结论：BP和PV患者外周血中Breg细胞数量增多，提示Breg细胞可能与自身免疫性疱病的发病有相关性。BP患者Breg细胞负向免疫调节功能存在缺陷，而且Breg细胞不能有效抑制辅助性T细胞和产生抗BP180NC16A抗体的B细胞的活性，这可能是这类疾病致病性自身抗体产生的重要机制之一。
【关键词】：调节性B细胞（Breg） 白介素-10（IL-10） 自身免疫 疱病 自身抗体
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R758.66
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-15
• 文献回顾15-31
• 一、自身免疫性疱病15-24
• 1 大疱性类天疱疮15-21
• 1.1 大疱性类天疱疮历史回顾15-16
• 1.2 大疱性类天疱疮自身抗原16-17
• 1.3 大疱性类天疱疮发病机制研究现状17-21
• 2 寻常型天疱疮21-24
• 2.1 天疱疮历史回顾21-22
• 2.2 寻常型天疱疮的自身抗原22
• 2.3 寻常型天疱疮发病机制的研究现状22-24
• 二、免疫调节细胞与自身免疫性疾病抗体产生机制的研究进展24-27
• 1 自身抗体产生的途径25
• 2 免疫调节细胞亚群抑制致病性抗体的产生25-27
• 三、调节性 B 细胞27-31
• 1 调节性 B 细胞的历史27-28
• 2 调节性 B 细胞分化和功能相关分子28-29
• 3 调节性 B 细胞的来源与分化29
• 4 人调节性 B 细胞29-31
• 1 材料31-35
• 1.1 主要仪器设备31-32
• 1.2 主要试剂32-33
• 1.3 主要试剂配制33-35
• 1.4 研究对象35
• 2 方法35-44
• 2.1 外周血单个核细胞（PBMC）的分离35
• 2.2 血清的分离与保存35-36
• 2.3 全血 RNA 的提取与保存36
• 2.4 自身免疫性疱病患者 CD19~+IL10~+细胞水平的检测36-37
• 2.5 自身免疫性疱病患者 Breg（CD19~+CD24~(hi)CD27~+）细胞水平的检测37
• 2.6 血清中 IL-10 水平的检测37-38
• 2.7 外周血 IL-10 RNA 水平的检测38
• 2.8 健康人及 BP 患者外周血 Breg 细胞对效应 T 细胞增殖的影响38-40
• 2.9 健康人及 BP 患者外周血 Breg 细胞对效应 T 细胞炎症因子产生的影响40-41
• 2.10 重组人 BP180NC16A (GST-NC16A)抗原的表达、纯化及其活性检测41-43
• 2.11 BP 患者 Breg 细胞(CD19~+CD24~(hi)CD27~+)对致病性抗体产生的影响43-44
• 3 结果44-53
• 3.1 自身免疫性疱病患者外周血 CD19~+IL10~+细胞数量增加44-45
• 3.2 自身免疫性疱病患者外周血 Breg (CD19~+CD24~(hi)CD27~+)细胞的数量增加45-47
• 3.3 自身免疫性疱病患者外周血 IL-10 水平的变化47-48
• 3.4 BP 患者 Breg 细胞对效应 T 细胞增殖的抑制作用减弱48-49
• 3.5 BP 患者 Breg 细胞对效应 T 细胞产生炎症因子的抑制作用减弱49-51
• 3.6 大疱性类天疱疮患者 Breg 细胞对致病性抗体产生的抑制作用丧失51-53
• 4 讨论53-55
• 小结55-56
• 参考文献56-75
• 附录75-78
• 个人简历和研究成果78-79
• 致谢79-80

【共引文献】

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本文编号：570276