CD147与NDUFS6结合对恶性黑素瘤细胞线粒体功能和凋亡的影响

发布时间：2017-08-01 01:00

  本文关键词：CD147与NDUFS6结合对恶性黑素瘤细胞线粒体功能和凋亡的影响

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【摘要】：研究背景 恶性黑素瘤是一种恶性程度极高的肿瘤,预后差,极易发生侵袭转移。其生长旺盛、分裂增殖速度快,并拥有肿瘤的典型特征-能量代谢异常,这其中包括氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)的改变。OXPHOS主要是由线粒体电子呼吸链复合物完成,是细胞高效的产能过程,与肿瘤生长速度相关,并在转移性恶性黑素瘤细胞中水平升高。 CD147/Basigin (BSG)是一种高糖基化的跨膜糖蛋白,在包括肿瘤细胞在内的多种代谢活跃的细胞膜上高表达,可作为分子伴侣与其他一系列蛋白结合,形成复合物在炎症、肿瘤等过程中发挥重要功能。既往研究表明,CD147与恶性黑素瘤的增殖、侵袭、血管生成、转移等过程密切相关,而肿瘤的侵袭转移离不开能量代谢,用siRNA技术干扰CD147的表达可通过下调细胞的糖酵解从而抑制黑素瘤的恶性行为。然而,CD147与OXPHOS的关系尚未明了。因此,本研究旨在明确CD147是否可与恶性黑素瘤线粒体上相关蛋白结合而影响线粒体相关功能,进而调节OXPHOS水平,参与肿瘤能量代谢。 研究目的 1.研究CD147在原位和转移性恶性黑素瘤组织中的表达位置； 2.探讨CD147在恶性黑素瘤细胞线粒体上的表达,进而找出其在线粒体上可能的相关结合蛋白； 3.探讨CD147是否与线粒体上相关蛋白结合而影响恶性黑素瘤细胞线粒体复合物Ⅰ的活性； 4.探讨CD147是否通过线粒体通路对恶性黑素瘤细胞活性和凋亡产生影响。 研究方法 1.利用免疫组化方法检测10例原位恶性黑素瘤和10例转移性恶性黑素瘤中CD147的表达,分析其表达位置的差异； 2.分离A375细胞的线粒体和胞浆蛋白,利用western blot检测CD147在A375细胞线粒体上的表达； 3.用细胞免疫荧光检测方法明确CD147在A375细胞线粒体上的定位； 4.采用酵母双杂交的方法找出CD147在线粒体上的可能结合蛋白—NDUFS6,构建了CD147-Myc和Flag-NDUFS6的质粒,并在HEK293T细胞中共转,利用免疫共沉淀和免疫荧光共聚焦法验证两者之间的结合; 5.构建了分别敲除CD147胞外Ig样结构域Ⅰ(Ig domain Ⅰ, delete34-89)、胞外Ig样结构域Ⅱ (Ig domain Ⅱ,delete105-199)、跨膜段(Transmembrane domain, delete207-230),胞内段(Cytoplasmic domain, delete231-end)及同时敲除跨膜段和胞内段(Transmembrane and Cytoplasmic domains, delete207-end)的质粒,均带有Myc-tag,利用免疫共沉淀法明确CD147与NDUFS6的结合区段,并用细胞免疫荧光共聚焦法进一步验证； 6.利用siRNA技术干扰A375细胞中CD147的表达,用免疫印迹法验证转染的有效性,将正常对照(normal control)和干扰CD147的A375细胞分别命名为A375-siNC和A375-siCD147[或A375-siBSG); 7.利用Dipstick试剂盒检测A375-siNC和A375-siCD147细胞中线粒体复合物Ⅰ的活性； 8.用线粒体损伤药物黄连素处理A375-siNC和A375-siCD147细胞,用Alamar Blue法检测细胞活性； 9.用黄连素处理A375-siNC和A375-siCD147细胞,检测凋亡水平(免疫印迹法检测Cleaved-PARP表达); 10.在A375-siNC和A375-siCD147细胞中过表达Bcl-2,用黄连素处理细胞,检测凋亡水平(免疫印迹法检测Cleaved-PARP表达)。 研究结果 1.在20例标本中,黑素瘤细胞膜上均有不同程度的CD147的表达,而在2例原位癌和8例转移癌中出现明显的胞浆分布; 2.CD147在A375细胞的线粒体中有高表达,并与ATP5B在线粒体上存在共定位； 3.酵母双杂交筛选出NDUFS6可能作为CD147潜在的结合蛋白。 4.用免疫共沉淀方法检测到CD147与NDUFS6存在相互作用,免疫荧光共聚焦检测到二者在A375细胞中有共定位； 5.用Flag抗体沉淀含不同缺失区段的CD147-Myc,检测到敲除了CD147胞外Ig样结构域I和敲除跨膜段后与NDUFS6无结合；提示这两个区段可能为二者结合部位,免疫荧光共聚焦共定位结果与之一致； 6. CD147siRNA的2个不同干扰位点分别下调了A375细胞线粒体复合物Ⅰ的活性25.1%和27.8%(P0.05)； 7. CD147siRNA显著降低了黄连素处理后的A375细胞活性(P0.01); 8. CD147siRNA上调了黄连素引起的A375细胞中Cleaved-PARP的表达水平,在A375-siNC和A375-siCD147细胞中加入外源性的Bcl-2可保护黄连素引起的凋亡。 结论 1.CD147在转移的恶性黑素瘤中有向胞浆转位的趋势； 2.CD147在恶性黑素瘤A375细胞线粒体上与NDUFS6相互作用,影响线粒体复合物Ⅰ的活性,进而可能参与恶性黑素瘤能量代谢的OXPHOS过程；3.CD147可能通过线粒体途径增强A375细胞活性,减少其凋亡。
【关键词】：CD147 Complex Ⅰ活性 细胞凋亡 恶性黑素瘤 黄连素 NDUFS6 线粒体
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 缩略语表14-16
• 前言16-18
• 第一章 材料与方法18-36
• 1.1 试剂和耗材18-21
• 1.1.1 主要试剂18-20
• 1.1.2 主要耗材20-21
• 1.2 主要仪器21-22
• 1.3 主要试剂的配制22-24
• 1.4 实验方法24-35
• 1.4.1 细胞培养24-25
• 1.4.2 组织芯片的免疫组化25-26
• 1.4.3 线粒体与胞浆蛋白提取及免疫印迹检测蛋白水平26-27
• 1.4.4 酵母双杂交27-28
• 1.4.5 分子克隆与PCR28-32
• 1.4.6 细胞免疫荧光32-33
• 1.4.7 小干扰RNA的构建和转染33
• 1.4.8 免疫共沉淀33-34
• 1.4.9 线粒体电子呼吸链复合物Ⅰ活性检测34-35
• 1.4.10 细胞活力测定35
• 1.5 统计学分析35-36
• 第二章 结果36-46
• 2.1 CD147在原位和转移性恶性黑素瘤组织中的表达36
• 2.2 CD147在A375细胞线粒体中的表达36-37
• 2.2.1 A375细胞线粒体蛋白和胞浆蛋白中CD147的表达36-37
• 2.2.2 CD147与ATP5B在A375细胞线粒体上共定位37
• 2.3 CD147在线粒体上的可能结合蛋白的筛选与鉴定37-39
• 2.3.1 筛选CD147的可能结合蛋白37-38
• 2.3.2 在HEK293T细胞中过表达CD147和NDUFS638
• 2.3.3 免疫共沉淀验证CD147与NDUFS6的特异性结合38-39
• 2.3.4 细胞免疫荧光验证CD147与NDUFS6的共定位39
• 2.4 明确CD147与NDUFS6的结合区段39-41
• 2.4.1 将敲除了不同结构区域的CD147-Myc质粒在HEK293T细胞中与Flag-NDUFS6质粒共转,免疫共沉淀找出结合区段39-40
• 2.4.2 细胞免疫荧光进一步验证CD147与NDUFS6的结合区段40-41
• 2.5 CD147SIRNA对线粒体电子呼吸链复合物Ⅰ活性的影响41-43
• 2.5.1 线粒体复合物Ⅰ活性标准曲线的制作41-42
• 2.5.2 A375细胞中用siRNA干扰CD147的表达42
• 2.5.3 CD147 siRNA对A375细胞线粒体复合物Ⅰ活性的影响42-43
• 2.6 CD147sIRNA对黄连素处理的A375细胞活力的影响43-44
• 2.7 CD147sIRNA对黄连素引起的A375细胞线粒体凋亡途径的影响44-46
• 2.7.1 CD147siRNA增加了黄连素引起的A375细胞凋亡44-45
• 2.7.2 CD147siRNA通过线粒体途径增加了黄连素引起的A375细胞凋亡45-46
• 第三章 讨论46-49
• 结论49-50
• 参考文献50-56
• 综述56-68
• 参考文献62-68
• 致谢68-69
• 攻读学位期间主要研究成果69

【共引文献】

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本文编号：601832