沙利度胺对正常人真皮成纤维细胞增殖活性及胶原代谢的影响
本文关键词：沙利度胺对正常人真皮成纤维细胞增殖活性及胶原代谢的影响
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【摘要】：背景：病理性瘢痕和局限性硬皮病是一类以真皮细胞因子活性异常及连续产生大量的细胞外基质蛋白为特征的纤维化性疾病。主要是由于成纤维细胞的过度生长和胶原蛋白合成、分泌紊乱以及过度沉积所造成。目前对这类疾病的治疗和预防局限，效果较差。沙利度胺，被广泛用于镇静催眠、睡眠诱导及妊娠止吐后因其明显的致畸作用被停用。随着沙利度胺能有效治疗麻风结节性红斑的发现，国内外已有研究证实沙利度胺具有抗血管生成、抗炎，免疫调节等多种生物学作用，主要通过抑制VEGF、TNF-a因子影响细胞迁移、粘附凋亡，抑制肿瘤血管生成，在关节炎、多发性骨髓瘤及一些难治性皮肤病中广泛应用。它能抑制滑膜成纤维细胞及胶原蛋白合成，并可通过抑制细胞增值、TGF-β1、TNF-α、VEGF及胶原的表达而具有抑制肝纤维化、肺纤维化的作用[1]。它能通过干扰p38/Smad3作用通路抑制TGF-β1处理的正常及瘢痕疙瘩成纤维细胞纤连蛋白产生，可以证实沙利度胺具有抗瘢痕形成的潜在作用[2]。这些研究大多是从抑制炎症因子活性，干扰通路等方面进行阐述，，但对其作用于真皮成纤维细胞，对细胞增殖及细胞外基质直接影响的研究甚少，本课题通过研究沙利度胺对正常真皮成纤维细胞增殖及主要细胞外基质蛋白的直接影响，为今后其对活化后成纤维细胞影响的研究奠定理论基础，初步探讨沙利度胺的抗真皮纤维化的潜在作用，为防止术后瘢痕形成及硬皮病的临床治疗提供新的指导思路。 目的：探索沙利度胺对正常人真皮成纤维细胞的增殖活性及胶原表达的影响，及胶原代谢的调节机制。 方法： 1使用含体积分数20%胎牛血清的DMEM培养基,通过消化-组织块混合法进行人正常真皮成纤维细胞原代培养，并通过对波形蛋白免疫组化染色，进行细胞鉴定。 2CCK-8法检测成纤维细胞增殖 实验用第4代成纤维细胞。细胞消化后按相同密度接种于96孔培养板中，每组均设置6个重复孔。分别在每组中加入含有浓度分别为0（空白对照组）、10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L含沙利度胺的DMEM培养基（标为A0、A-4、A-5、A-6、A-7）。同时设立调零孔，调零组只加空白培养基，用CCK-8法检测沙利度胺作用24h后细胞在560nm处的光密度值（OD值），判断在不同的浓度下，沙利度胺对正常人真皮成纤维细胞增殖的影响，并对结果进行统计学分析。 3western blot及荧光定量PCR法测定Col1-a1蛋白及其mRNA表达水平，以及胶原蛋白合成相关调节因子（TGF-β1、MMP-1、TIMP-1）mRNA的表达情况。 成纤维细胞经传代后随机分为5组，分别加入含沙利度胺浓度为0、10-4mol/L,10-5mol/L，10-6mol/L,10-7mol/L的培养基，每组设三个样本。均接种在25mL培养瓶中继续培养。24h后提取各组总RNA。应用荧光定量PCR对Col1-a1、TGF-β1、MMP-1、TIMP-1基因的表达量进行测定。同样分组，接种于75ml培养瓶，24h提取各组总蛋白,蛋白定量、电泳、转膜、加抗体并进行化学发光和图像相对定量分析，应用western blot法对Col1-a1进行蛋白水平测定。 4ELISA法检测TGF-β1分泌量并做统计学分析。 离心收集以上PCR各组细胞上清，通过ELISA法检测成纤维细胞外TGF-β1分泌情况。所得数据结果进行统计学分析。 结果： 1CCK-8的结果显示:5个处理组的细胞活性不全相等，即不同浓度沙利度胺对正常人真皮成纤维细胞的增殖有抑制作用（，组间比较F=18.023，P0.05），组内比较时，A组中，A-4A-5A-6能抑制细胞增殖，且两两比较均有统计学意义，A-7与对照组A0之间无显著性差异（P0.05）。沙利度胺10-4、10-5、10-6药物浓度与细胞活性符合直线负相关，相关系数R=-0.972，P=0.0280.05。 2Col1-a1蛋白及其mRNA表达水平，以及TGF-β1、MMP-1、TIMP-1的mRNA数据统计学分析如下：沙利度胺不同浓度组处理正常成纤维细胞24h后，COL1-A1mRNA及其蛋白表达均低于对照组，且差异具有统计学意义（P0.05）。组内两两比较，均有显著性差异（P0.05）。相关分析表明：药物浓度与Col1-a1表达符合直线负相关，PCR检测中相关系数R=-0.972，western中相关系数R=-0.984，P0.05。 不同浓度组沙利度作用于正常成纤维细胞后，TGF-β1mRNA的表达较正常对照组均降低，差异具有统计学意义（P0.05）。组内比较时，除A-6和A-7外的任两组间比较均具有统计学意义，A-5时抑制作用最明显。MMP-1mRNA表达均有不同程度的升高，差异均有统计学意义（P㩳0.05），且两两比较各浓度组之间具有显著性差异（P0.05）。TIMP-1mRNA表达较空白对照组降低，且差异显著（P0.05），组内多重比较时除A-4和A-5之间无显著性差异外，其余任处理组间两两比较差异均有统计学意义。 4ELISA法测定TGF-β1实验结果统计分析如下：A-4、A-5较空白对照组分泌量减少，差异具有统计学意义（P0.05）。但A-4、A-5组内比较两者并无显著性差异（P0.05）。 结论： 1正常人真皮成纤维细胞原代培养成功，细胞呈长梭形，且波形蛋白表达阳性 2CCK-8实验显示THD作用于人正常真皮成纤维细胞时，10-4、10-5、10-6能抑制细胞增殖，其药物浓度与细胞活性符合直线负相关。但10-7浓度时对正常成纤维细胞增殖无影响。 3沙利度胺作用于正常成纤维细胞，从基因和蛋白水平均能抑制Col1-a1表达。且呈现一定的剂量效应关系。 4沙利度胺在一定浓度范围可降低TGF-β1mRNA表达及细胞外该因子的分泌水平。并能上调MMP-1下调TIMP-1mRNA,以减少胶原合成，促进降解。
【关键词】：沙利度胺 人真皮成纤维细胞 Col1-a1 TGF-β1 MMP-1 TIMP-1
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R751
【目录】：
- 摘要4-7
- ABSTRACT7-11
- 英文缩写11-12
- 前言12-13
- 材料与方法13-20
- 结果20-22
- 附图22-27
- 附表27-29
- 讨论29-33
- 结论33-34
- 参考文献34-37
- 综述 细胞外基质的最新研究进展37-52
- 参考文献46-52
- 致谢52-53
- 个人简历53
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 黄品秀;韦继红;;层粘连蛋白与子宫内膜异位症发病机制及其不孕原因的关系[J];中国优生与遗传杂志;2013年09期
2 田珊;陈周;;弹性蛋白肽在皮肤科应用研究的进展[J];中国皮肤性病学杂志;2013年08期
3 张红;邬时国;干亚丹;;MMP-2、MMP-9及TIMP-2、TIMP-1在非黑色素性皮肤癌中的表达[J];中国现代医生;2013年11期
4 丁丹霞;马刚;陈婷;;TGF-β1和MMP-2在病理性瘢痕表皮中的表达和意义[J];皮肤性病诊疗学杂志;2013年01期
5 蒙喜永;;miR-200c对TGF-β_1刺激后人瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的影响[J];中国美容医学;2012年02期
6 袁媛;周静;姜政;;核心蛋白聚糖生物学的研究进展[J];医学综述;2011年09期
7 辛培成;杨圣;芦健民;赵德伟;;CCK-8法检测兔筋膜成纤维细胞增殖活性之最佳测试条件研究[J];中外医学研究;2011年12期
8 胡孝辉;高丰厚;方勇;;中波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞衰老及机制研究[J];上海交通大学学报(医学版);2010年07期
9 张鹏;纪亮;李静平;沈雷;陈永春;李云峰;;MMP-1和TIMP-1在人增生性瘢痕中的动态变化[J];中国现代医学杂志;2010年11期
10 季鑫;高春芳;;TGFβ1基因单核苷酸多态性与疾病的关系[J];现代免疫学;2009年02期
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1 李懿莎;miR-145在硬皮病TGF-β/Smad3促纤维化通路中的作用及机制研究[D];中南大学;2012年
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