miR-203与SOCS3的相互作用及其在HaCaT细胞中的机制研究

发布时间：2017-08-23 02:39

  本文关键词：miR-203与SOCS3的相互作用及其在HaCaT细胞中的机制研究

  更多相关文章： miR-203 阿维A SOCS3 STAT3

【摘要】：[研究目的] microRNAs (miRNAs)是一种类似于siRNA的,长约19～25个核苷酸的小分子非编码RNA,广泛存在于动植物和哺乳动物体内,它能与靶分子3'端非编码区域(3'-untranslated region,3'UTR)特异性结合,能抑制转录后翻译或蛋白降解,从而参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程。估计有1048种miRNAs参与了人类基因的调控。因此,对于microRNAs的作用,尤其是其靶基因的鉴定和研究,是目前研究的主要热点之一。 MiR-203是一个皮肤特异性表达的miRNA,并在银屑病的表皮中表达增加,与此同时,SOCS3(STAT-Induced STAT Inhibitor3)的表达下降。在肿瘤中的大量研究显示：1miR-203具有抑制细胞增殖的作用,并能与特异性的靶分子结合从而在疾病的发生发展中发挥重要作用。 鉴于以上研究背景,在本研究中我们主要探讨miR-203与SOCS3之间的关系,以及在人类永生化细胞株(HaCaT)细胞中作用机制。 [研究方法和结果] 1.基于生物信息学在线软件预测及数据库比对的方法,发现SOCS3基因3'UTR区位于miR-203结合的“种子”序列上,预测两者可能存在相互结合从而改变基因表达水平。 2.通过荧光素报告基因分析方法,观察miR-203与SOCS3的结合情况,在外源给予'mimic miRNA-203'序列和包含SOCS3基因3'UTR区的荧光素酶报告基因载体共同转染HEK293T细胞的实验中,发现荧光素酶报告基因的活性下降。 3.采用western blot的方法进一步验证了miR-203对SOCS3表达的影响,采用miR-203的模拟剂瞬时转染HEK293T细胞后,SOCS3的蛋白水平显著降低。 4.采用western blot的方法观察miR-203的模拟剂对STAT3(Signal Transducers and Activators of Transcription, are transcription factors3)信号通路的影响。 5.采用流式细胞仪的方法。我们发现miRNA-203模拟剂能增加在S期的细胞数量。 6.为进一步了解miRNA-203在银屑病治疗中的作用。阿维A诱导的HaCaT细胞外源性给予miR-203的抑制剂,采用流式细胞仪观察其细胞周期。我们发现阿维A能增加S期细胞数量,减慢细胞增殖,但这种效应被1miR-203的抑制剂所逆转。 [结论] 1.SOCS3基因是miR-203的一个潜在靶基因； 2. miR-203负向调控SOCS3,并活化STAT3信号通路； 3.阿维A能影响HaCaT细胞的细胞周期,这种作用能被miR-203的抑制剂所逆转；
【关键词】：miR-203 阿维A SOCS3 STAT3
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R758.63
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 前言11-13
• 第一章 miR-203靶基因研究13-26
• 1 材料与方法13-14
• 1.1 主要试剂和仪器13-14
• 2 实验方法14-19
• 2.1 生物信息学方法预测14
• 2.2 构建报告基因质粒14-16
• 2.3 报告基因质粒的连接16-17
• 2.4 报告基因质粒的鉴定17
• 2.5 细胞培养及转染17-18
• 2.6 荧光素酶报告基因活性检测18-19
• 3 统计学分析19
• 4 结果19-24
• 4.1 miR-203潜在靶基因预测结果19-20
• 4.2 报告基因质粒的构建和鉴定20-23
• 4.3 SOCS3是miR-203的直接的靶基因23-24
• 5 讨论24-26
• 第二章 miR-203负向调控SOCS3,并活化STAT3信号通路26-46
• 1 材料与方法26-27
• 1.1 主要试剂和仪器26-27
• 2 实验方法27-39
• 2.1 设计并合成SOCS3和内参照β-actin的引物27
• 2.2 HEK293T细胞中总RNA抽提27-28
• 2.3 逆转录反应28
• 2.4 real-time PCR反应28-29
• 2.5 Western Blotting法检测SOCS3,STAT3和p-STAT3蛋白的表达水平29-35
• 2.6 人胚肾细胞(HEK293T细胞)中miR-203的表达35-38
• 2.7 细胞培养实验分组38-39
• 3 统计学分析39-40
• 4 实验结果40-42
• 4.1 miR-203降低SOCS3的表达40-41
• 4.2 miR-203模拟剂对STAT3信号通路的影响41
• 4.3 miR-203模拟剂能抑制HaCaT细胞增殖41-42
• 4.4 miR203抑制剂能逆转阿维A对HaCaT细胞的抗增殖作用42
• 5 讨论42-45
• 6 结论45-46
• 参考文献46-50
• 综述50-81
• 参考文献69-81
• 攻读学位期间主要的研究成果81-82
• 致谢82

【共引文献】

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本文编号：722552