MicroRNA-125b抑制恶性黑色素瘤细胞的生长及相关信号通路的研究

发布时间：2017-08-23 12:01

  本文关键词：MicroRNA-125b抑制恶性黑色素瘤细胞的生长及相关信号通路的研究

  更多相关文章： 恶性黑色素瘤 miR-125b MLK3 慢病毒 增殖 凋亡

【摘要】：背景:黑色素瘤是一种侵袭性极强的恶性肿瘤,在过去30年它是所有类型癌症中发病率增长最快的恶性肿瘤之一。虽然经历了几十年的研究和药物开发,但其治疗效果仍不理想,该肿瘤发生、发展的分子机制也尚未完全阐明。目前已知miRNA是一类非编码小分子RNAs,在转录后水平调控基因的表达,参与生物复杂生命过程的调控,尤其是肿瘤的发生和进展。因此,尝试通过对黑色素瘤miRNA及其靶基因和相关信号通路的研究,为黑色素瘤的早期诊断和治疗提供新依据。目的:预实验已经证实miR-125b在黑色素瘤中低表达,靶基因是MLK3。本实验通过构建miR-125b过表达稳转黑色素瘤细胞系,观察过表达miR-125b对细胞增殖、凋亡和周期的影响,确定miR-125b在黑色素瘤中的抑癌作用,并进一步探索与miR-125b发挥抑瘤作用相关的可能信号通路。阐明miR-125b在黑色素瘤中发挥抑癌基因作用的分子机制,为后期临床治疗提供依据。方法:构建microRNA-125b过表达慢病毒,转染原发性黑色素瘤细胞A375和侵袭性黑色素瘤胞SK-MEL-5,得到稳定转染细胞株。转染目的病毒的为实验组A375-125b up、SK-125b up,转染空载病毒的为阴性对照组A375-negative、SK-negative,未转染病毒的为空白组A375、SK-MEL-5。采用RT-PCR法检测各组细胞miR-125b的表达水平,MTT法检测细胞的增殖情况,流式细胞术检测细胞的凋亡和细胞周期。Western Blot检测靶蛋白MLK3的表达水平,及各通路上关键蛋白(p-C-jun、C-jun、ERK1/2、MEK2、p-AKT、AKT1)的表达水平。结果:1.RT-PCR结果显示:miR-125b在实验组细胞中的表达量较空白组、阴性对照组的表达量明显增多(P0.05),证实miR-125b在转染细胞中有效过表达;而阴性对照组细胞中miR-125b的表达量与空白组无明显差异(P0.05)。2.MTT结果显示:A375-125bup细胞与A375-negative细胞、空白组细胞相比增殖活性明显降低(P0.05),而A375-negative细胞较空白组细胞增殖活性无明显差异(P0.05);SK-MEL-5细胞与A375细胞的变化趋势相同。3.流式检测结果:A375-125bup细胞与A375-negative细胞相比早期凋亡率明显增高(P0.05),G0/G1期的细胞比例明显增多而S期细胞比例减少(P0.05);SK-125bup细胞与SK-negative细胞相比也有同样趋势的变化,均有统计学差异。4.Western Blot结果显示:MLK3在A375-125bup细胞中的表达低于A375-negative细胞中的表达(P0.05),p-C-jun、C-jun、ERK1/2、MEK2、p-AKT、AKT1在A375-125bup细胞中的表达量较于阴性对照组细胞均下降(P0.05);SK-MEL-5细胞各蛋白的变化趋势与A375细胞相同,证实过表达的miR-125b抑制靶基因MLK3的表达,并可能通过阻滞C-jun、ERK、AKT通路发挥抑瘤作用。结论:1.成功构建miR-125b过表达慢病毒载体,稳转成功的黑色素瘤细胞细胞内miR-125b的表达上调。2.MiR-125b表达上调能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,细胞周期阻滞在G0/G1期,发挥抑瘤作用。3.MiR-125b的靶点为MLK3蛋白,而且对C-jun通路、ERK通路以及AKT通路均有影响。4.MiR-125b有望成为治疗人恶性黑色素瘤有效靶点。
【关键词】：恶性黑色素瘤 miR-125b MLK3 慢病毒 增殖 凋亡
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文缩略词表10-11
• 第1章 引言11-15
• 第2章 材料与方法15-31
• 2.1 材料15-19
• 2.1.1 实验细胞15
• 2.1.2 主要试剂15-16
• 2.1.3 仪器设备16-17
• 2.1.4 实验试剂的配置17-19
• 2.2 实验方法19-30
• 2.2.1 细胞培养相关实验19-21
• 2.2.2 慢病毒过表达载体感染A375细胞21-22
• 2.2.3 实验分组22-23
• 2.2.4 RT-PCR方法检测各组细胞中miRNA-125b的表达23-25
• 2.2.5 生物功能学检测25-27
• 2.2.6 Western blot技术检测各组细胞中蛋白的表达27-30
• 2.3 统计学处理30-31
• 第3章 结果31-38
• 3.1 各组细胞的镜下形态31-32
• 3.2 RT-PCR方法检测各组细胞中miRNA-125b的表达32-33
• 3.2.1 RNA完整性32
• 3.2.2 MiRNA-125b表达32-33
• 3.3 生物功能学检测结果33-37
• 3.3.1 细胞的增殖功能检测33-34
• 3.3.2 细胞的凋亡功能检测34-36
• 3.3.3 细胞的周期功能检测36-37
• 3.4 转染慢病毒后各关键蛋白在细胞中的表达结果37-38
• 第4章 讨论38-42
• 第5章 结论42-43
• 致谢43-44
• 参考文献44-47
• 攻读学位期间的研究成果47-48
• 综述 MicroRNA在黑色素瘤中的研究进展48-58
• 参考文献55-58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 薄纯锐;胡雪玲;孙丽华;;MicroRNA-125的生理功能及其在疾病中的作用[J];中国医药导报;2014年28期

2 刘宁;肖君刚;潘敏;郁博;;阻断NF-κB和ERK通路对黑素瘤细胞增殖及凋亡的影响[J];中国皮肤性病学杂志;2014年07期

3 张洽;陆建波;;恶性肿瘤信号通路的研究进展[J];肿瘤基础与临床;2014年02期

4 衣世明;王培林;;MLK3与肿瘤的关系[J];中国社区医师(医学专业);2013年21期

5 刘宁;肖君刚;潘敏;;MEK/ERK通路阻断剂对黑素瘤细胞增殖的影响[J];中国皮肤性病学杂志;2012年11期

6 吕俊杰;陶秀娟;;恶性黑色素瘤的治疗研究进展[J];中国肿瘤;2012年08期

7 Jeffrey Weber;;恶性黑色素瘤的免疫治疗进展[J];中国肿瘤临床;2012年09期

8 ;HBx activates FasL and mediates HepG2 cell apoptosis through MLK3-MKK7-JNKs signal module[J];World Journal of Gastroenterology;2012年13期

9 王园园;王义善;王鑫;杨柯;杨桂青;;PI3K/Akt信号通路与恶性黑色素瘤浸润转移的研究进展[J];实用医学杂志;2012年02期

10 侯炳旭;冯丽英;;JNK信号通路介导的凋亡在疾病中的作用[J];世界华人消化杂志;2011年17期

，

本文编号：724901