腋臭发病机制的基因学研究及外科治疗手段的探索

发布时间：2017-08-29 16:25

  本文关键词：腋臭发病机制的基因学研究及外科治疗手段的探索

  更多相关文章： 腋臭 单核苷酸多态性(SNP) ABCC11 RT-PCR 腋臭 治疗 复发 抽吸

【摘要】：第一部分腋臭发病机制的研究：中国腋臭人群中ABCC11基因SNP 538不同基因型的研究引言人类腋窝的皮下含有大量的腺体,包括大汗腺(顶泌汗腺)、小汗腺、皮脂腺等。在这些腺体作用下,该区域能分泌大量的气化有机物质(VOCs, Volatile organic compounds),形成特殊的体味,在某些国家将此定义为“腋臭”。腋臭在西方发病率高达95%以上,东方国家中,韩国的调查为低于5%。随着对社交的发展、个人形象的重视,据调查,美国人每年花在腋臭外用药方面的费用高达1.9亿美元。在英国,超过90%的女性和80%以上男性把除臭剂和止汗剂作为日常用品。某种意义上,腋臭已经不仅仅局限为一个生理学症状,而被定义为一种疾病,涉及到心理学、经济学等领域。对腋臭的发生机理、分子学机制也愈加重视。近来,随着基因技术的突破,腋臭的基因学研究有了很大进展,大量研究表明ABCC11基因与腋臭密切相关。ABC (ATP结合盒)蛋白是人类基因组编码的蛋白大家族,其主要参与细胞膜的转运过程。ABC家族目前发现有48个成员,分属ABCA, ABCB和ABCC亚家族。C亚家族包括多耐药相关蛋白(MRPs, Multidrug Resistance-associated Proteins),目前已知12个成员,包括由ABCC11(MRP8)基因编码的转运蛋白。ABCC1最早被发现,其的结构包括3个跨膜区和2个核苷酸结合区以及它们之间的连接部。2001年,ABCC11作为ABC转运子被发现(位于染色体16q12.1)。在三维结构上,ABCC2、ABCC3、ABCC6、ABCC10和ABCC1相似,而ABCC4、ABCC5、ABCC11和ABCC12的结构因缺少第3个跨膜区MSDO而与之略有不同。进一步研究发现,ABCC11基因表达的蛋白位于顶泌汗腺的细胞内颗粒和空泡膜上,提示直接影响或参与顶泌汗腺内中性气味前体和亲脂性气味物质的转运,包括气体前体在内的多种物质在其作用下被转运至大汗腺的管腔内,完成分泌过程。ABCC11基因的转运包括一些亲脂阴离子,如某些谷氨酰基结合体(Gln-3M2H、Gln-HMHA、SG-3M3SH)和白三烯,阴离子胆汁酸,甘氨胆酸等。其中3M2H、HMHA和3M3SH均已被证实为引起腋臭的主要“气味前体”。然而ABCC11基因对转运的影响是直接的还是间接调控的目前尚未清楚。单核苷酸多态性(SNPs)是ABCC家族的主要变异,这些突变频率不一的变异分布于各个基因的内含子和外显子。位于编码区内的SNPs包括错义突变、无义突变及同义突变。同义突变会导致mRNA的二级结构发生改变,仅在表达水平上导致蛋白的改变,一般不会导致蛋白结构的改变。Yoshiura等研究发现ABCC11基因多态性位点SNP538决定耳耵聍的性状：-4A型多见于亚裔人群,表现为干性耳耵聍；而GA和GG型则多见于非洲及高加索人,表现为湿性耳耵聍。早在1937年Adachi有研究报道过耳耵聍形态与腋臭之间的联系,提出腋臭患者多伴湿性耳耵聍,而无腋臭者多为干性耳耵聍。本研究旨在了解中国人群中腋臭患者及非腋臭患者的ABCC11基因多态位点SNP538的基因型,及两者ABCC11基因表达量之间的区别,从基因水平进一步揭示腋臭的发病机制。材料与方法(1)实验对象分组：从2014年1月至2014年4月,本人所在机构所有首诊为“腋臭”的患者进入实验组候选队列。最终有12名候选人进入实验组,其中男性4例,女性8例,平均年龄为21岁。同期在本机构乳腺中心纳入确诊乳癌、拟行乳癌根治术+腋窝淋巴结清扫术的患者2例,为对照组。对照组2例均为女性,平均年龄48岁。本次研究的目的均在术前告知受试者,并签署知情同意书及术前风险告知书。(2)标本采集1)实验组：所有的实验组受试者均由同一组整形外科医生施行手术操作。6名患者施行术区皮下局部肿胀麻醉后,接受大汗腺抽吸术(具体手术方式参见论文第二部分),收集吸出的皮下混合组织。另6名患者施行术区皮下局部麻醉后,接受双侧大汗腺切除术(具体手术方式参见论文第二部分),直视下修剪腋窝皮下组织并获取标本。两种方法获取标本均为含有脂肪与大汗腺的混合组织碎片。2)对照组：2例对照组患者由同一组乳腺外科医生施行手术操作。手术在全麻下进行。完成腋窝淋巴结清扫后,切取小块腋下皮肤组织(不含淋巴结)。(3)组织学腋下大汗腺组织经福尔马林固定后,行石蜡包埋、切片,HE染色,行光镜组织学检查。(4)大汗胞4BCC11基因mRNA的RT-PCR分析从每个样品管中取出组织10mg,采用Trizol试剂盒提取总mRNA,琼脂糖凝胶电泳,通过紫外透射仪观察RNA。按逆转录酶说明书将3肛1总RNA逆转录成cDNA。取cDNA加入ABI PRISM 7500 RT-PCR扩增仪,SYBR Green用作PCR扩增反应。采取△△Ct法对目的基因的表达进行相对定量；用目的基因与GAPDH/POLR2A的比值表示目的基因的相对表达水平。PCI产物测序(上海天昊生物有限公司提供)。(5)统计方法：数据采用均数士标准差(x±s)表示,所有的数据进行SPSS(19.0)分析。因为样本数量偏少,无法满足t检验的假设,使用非参数方法的wilcoxon检验,以P0.05为差异有显著性。结果(1)组织学表现HE染色显示实验组、对照组均可见明显顶泌汗腺腺体,有完整的管腔结构,周围的分泌部由腺细胞、肌上皮细胞、基底膜带所组成,但不同标本内的分泌部的腺细胞高度不一,推测可能与分泌活动相关。(2)基因型检测结果本次实验共收集14例标本,其中实验组12例,对照组2例。经TRIZOL提取总mRNA, RT-PCR后,通过对ABCC11基因多态性位点SNP538的等位基因型检测发现实验组有11例为GA型,1例为GG型,对照组2例均为AA型。(3)目的基因表达水平本次实验共收集14例标本,其中实验组12例,对照组2例。经TRIZOL提取总mRNA, RT-PCR后,通过GAPDH、POLR2A双内参定量分析目的基因表达量。采取AACt法对目的基因的表达进行相对定量,用目的基因与GAPDH / POLR2A的比值表示目的基因的相对表达水平。结果发现12例实验组的标本中ABCC11基因表达量较对照组的表达量明显增高。经wilcoxon检验,实验组相对GAPDH ΔCt和相对POLR2A ACt的p值均为3.813e-07,有显著差异。结论ABCC11基因多态位点SNP538的基因型与腋臭发生密切相关。腋臭患者的ABCC11基因表现型为GG或GA型,其在mRNA水平表达较AA型无腋臭患者明显增高,提示ABCC11基因SNP538G→A导致该基因在mRNA水平的表达减弱。第二部分腋臭外科治疗方式的探索：改良小切口大汗腺抽刮法与传统大汗腺切除术的临床对比试验引言在高等哺乳类中,大汗腺能分泌一种特殊的气味,该气味承担着化学信号的作用,实为嗅觉交际,以此来吸引异性、发现危险,以及标记领地等,是一种生物学特征。人类的大汗腺也会分泌特殊的气味,该气味物质某种程度上反映了个体的情感状态、运动机能及疾病状态。然而在一些东方国家的特殊文化中,认为携带强烈腋下异味的个体是具体攻击性的,易被大众排斥,严重影响个人社交生活。甚至有部分亚洲国家将腋下异味视作一种疾病,称为“腋臭”。对腋臭的治疗经历了大半个世纪,主要分为非手术和手术两大类。非手术治疗中包括药物类的除臭剂、局部抗生素的应用、大汗腺的激光烧灼、A型肉毒杆菌素局部注射等方式,但均属于短暂时缓解症状,无法彻底治愈。手术的目的为去除大汗腺组织,包括各种大汗腺切除方式,经历了早期的腋下皮肤全层切除到之后的保留真皮下血管网的大汗腺切除术。早期的手术方式带给患者不可逆转的腋下疤痕,该方式渐渐被淘汰；经典的真皮下大汗腺切除术式虽然保留了腋下的皮肤,却依然存在皮肤坏死、血肿、伤口延迟愈合、手术疤痕、术后恢复时间长等一系列问题。近年来,源于脂肪抽吸技术的大汗腺微创抽吸术开始流行,其具有疤痕隐蔽、皮肤坏死率低、术后恢复快等优势,被认为是安全有效的腋臭外科治疗手段。但该术式的复发率一直存在争议。本人自2009年开始采用改良的小切口大汗腺抽刮术,并进行了临床配对试验,与金标准的大汗腺切除术式进行对比。现将结果阐述与此。材料与方法(1)受试者从2009年2月至2014年2月,本人所在机构所有首诊为“腋臭”的患者进入候选队列。纳入标准为：经临床查体确诊为双侧腋臭、且自愿参加此项临床试验的患者；曾经接受过腋臭外科治疗(包括激光)以及腋下区域有疤痕存在的患者被排除在外。本次研究均在术前告知受试者,并签署知情同意书及术前风险告知书。希望疤痕更隐蔽的患者被纳入试验组,接受腋下小切口大汗腺抽刮术；而其余所有患者进入对照组,施行经典的腋下大汗腺切除术式。两组受试者以非同步的方式进入研究队列。所有受试者的年龄、性别资料均被录入。最终有65名候选人进入实验组,超过300名归入对照组。经计算机统计配对,从对照组中随机选出65名与试验组性别一致、年龄差别Q岁的应试者与之进行配对。(2)手术方式1)实验组：进行术区及切口标记,术区皮下进行局部肿胀麻醉,单侧150-200m1,范围超过标记外缘1cm。肿胀麻醉达成后,沿切口标记切开皮肤(0.2cm),用抽吸针进行皮下潜行分离,范围为术前标记的整个腋毛区。随后将抽吸管一头连于负压吸引器,调节负压为1.875mmHg。整个抽吸过程在15分钟左右,分为两阶段。第一阶段为“手压式”抽吸,将真皮层与皮下脂肪层之间抽吸形成潜行腔隙(多隧道)；第二阶段为“提捏式”抽吸,用左手拇指与食指提捏术区皮肤包绕抽吸管,同时旋转抽吸管对该区域进行270°抽吸。完成此过程后,对术区皮肤厚度进行评估,应能透过皮肤看到其下抽吸管的金属光泽及抽吸孔的形状。用50-80m1的生理盐水对术区皮下浅腔进行灌洗以除去游离的脂肪颗粒及大汗腺组织。术区切口无需缝合,整个术区加压包扎。对侧同法操作。术毕让患者穿上医用弹力腋套,目的为腋部加压及固定敷料,一周内禁止摘除。同时宣教患者术后一周内禁止洗澡,并限制肩关节上举活动。2)对照组：术区标记完成后,进行局麻。局麻达成后,沿术前标记切开皮肤,用剪刀进行皮下分离,形成对偶皮瓣。用左手食指及中指协助掀起皮瓣,修剪其皮下表面的脂肪组织及大汗腺组织,直至看到乳白色的真皮组织,尽可能保留真皮下血管网。彻底止血后冲洗创面,皮内6-0尼龙线连续缝合切口。对侧同法操作。术区用弹力绷带加压包扎,7天后解除。告知患者术后一周内禁止洗澡,肩关节制动。(3)术后评估每位患者都进行术后随访,方式为门诊复诊或电话随访,安排在术后1月、3月、6月。每次随访都记录5项内容：患者满意程度、皮肤坏死情况、血肿、异味复发程度、疤痕。(4)数据统计数据采用均数士标准差(x±s)表示。所有的数据进行SPSS(19.0)分析,使用Chi square test和Fisher's exact test作为统计方法,p值.05视为有统计意义。结果两组的性别比例一致,女：男均为42：23。实验组年龄从15岁至38岁,平均22.78岁；对照组年龄从16岁至39岁,平均22.91岁。实验组的随访时间为3个月到40个月,平均7.69个月,对照组的随访时间为3个月到20个月,平均6.81个月。(1)患者满意程度22名(33.85%)实验组患者及8名(12.31%)对照组患者对术后结果完全满意。相较于对照组,实验组的患者满意率更高,有统计学显著差异(P=0.004, Chi square test).(2)皮肤坏死实验组有3名(2.31%)患者经历了腋下皮肤坏死,而对照组发生坏死的为16名(12.31%)。其中实验组只有1名患者的左侧腋下术区为严重坏死,并接受了二期皮瓣修复术后痊愈。对照组有8名患者诊断为严重坏死,并均接受了再次手术,包括重新清创缝合术(3例)、局部皮瓣修复术(5例)。发生严重坏死的患者,恢复时间均超过2周。实验组的术后皮肤坏死率低于对照组,有统计学显著差异(P=0.002, Chi square test,)。(3)血肿对照组发生3例(2.31%),实验组未发现。数据无统计意义(P=0.25, Fisher' s exact test.(4)异味复发术后共有15名实验组患者和6名对照组患者主诉有异味复发,经复诊评估后,其中实验组2名患者的3侧腋窝、对照组1名患者的双侧腋窝复发症状较明显,需要并接受了二次治疗。其余主诉有复发症状的患者,复发程度均较轻,且都肯定了手术的效果。实验组的术后复发率高于对照组,仅具有统计学差异(P=0.041, Chi square test)。(5)疤痕对照组的术后疤痕更长(平均长度3.61cm,n=130),外形更难看,表现为疤痕增生或疤痕挛缩,部分疤痕宽度3mm (P=0.000, Chi square test)。实验组的疤痕相对更隐蔽,(平均长度0.32cm,n=130),均不超过0.5cm。结论本次研究共有65位双侧腋臭患者接受双侧大汗腺改良抽吸术,与接受传统大汗腺切除术的对照组相比,试验组术后皮肤坏死率更低(1.88%,p0.01),患者满意率更高(33.85%,p0.01),异味复发率更高((11.54%,p0.05),疤痕更隐蔽美观(0.77%,p0.01)。所以,我们认为改良的大汗腺抽吸术是一种可供患者选择的方法,尤其适合爱美、快节奏的都市人群。
【关键词】：腋臭 单核苷酸多态性(SNP) ABCC11 RT-PCR 腋臭 治疗 复发 抽吸
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R758.741
【目录】：

• 致谢5-6
• 中文摘要6-16
• 英文摘要16-27
• 缩略词表27-31
• 第一部分：中国腋臭人群中ABCC11基因SNP 538不同基因型的研究31-61
• 绪论31-35
• 材料与方法35-43
• 结果43-48
• 讨论48-56
• 结论56-57
• 下一步研究57-58
• 参考文献58-61
• 第二部分：改良小切口大汗腺抽刮法与传统大汗腺切除术的临床对比试验61-86
• 绪论61-63
• 材料与方法63-72
• 结果72-77
• 讨论77-81
• 结论81-82
• 下一步研究82-83
• 参考文献83-86
• 综述86-106
• 参考文献98-106
• 作者简历及在学期间所取得的科研成果106-107

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本文编号：754298