银屑病HLA-Cw6相关miRNAs的筛选及其作用机制研究

发布时间：2017-08-30 22:19

  本文关键词：银屑病HLA-Cw6相关miRNAs的筛选及其作用机制研究

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【摘要】：背景： 银屑病(Psoriasis, PS)是一种以表皮细胞过度增殖及炎症为特征的慢性反复发性疾病。运用全基因组关联分析对银屑病易感基因研究显示HLA-Cw6是与银屑病免疫反应相关性最强的MHC易感基因,IL12B和IL23R是两个与炎症反应密切关联的非MHC易感基因,LCE3A和LCE3D编码异常角质化包膜蛋白。我项目组研究发现在银屑病的皮损和血液中存在大量差异表达的niRNAs,但其在银屑病发病进而病情进展中的具体机制尚不明确。现如今大多数研究仅局限在单个miRNAs和易感基因的研究上,随着系统生物学的发展,研究miRNAs具体功能以及和易感基因之间的关系则成为一个新的趋势。 目的： 本课题系导师杨志波教授多年来在银屑病等红斑鳞屑性皮肤病临床与实验研究基础上的拓展和延伸,旨在前期研究的基础上,运用生物信息学手段,初步构建寻常型银屑病患者差异表达miRNAs与HLA-Cw6、IL12B、IL23R、LCE3A和LCE3D的调控网络,并使用荧光实时定量PCR (RT-PCR)方法和原位杂交技术进行HLA-Cw6相关miRNAs的验证；最终通过体外细胞实验研究与HLA-Cw6相关miRNAs下游细胞因子及细胞增殖情况的变化。从miRNA与其下游易感基因及细胞因子和细胞增殖的关系层面探讨miRNAs在银屑病的发病机制,从而为银屑病的早期诊断和预后分析提供基础,并在治疗层面提供确切药物靶点和治疗靶点。 方法： 首先,根据前期研究,筛选出与银屑病密切相关的易感基因五个,差异表达miRNAs为我前期实验所得及结果,利用生物信息学方法,建立其调控网络。其次,对所需构建的miRNA及基因3’UTR序列进行引物设计、利用PCR扩增目的基因序列、将扩增好的产物进行琼脂糖凝胶电泳分离及胶回收片段、用XhoI和BamHI双酶切PCR片段、用XhoI和BamHI双酶切载体质粒pLMP、连接目的片段和载体、细胞培养、细胞转染、荧光素酶活性检测。最后,培养HacaT细胞,将与HLA-Cw6相关的miRNAs进行转染或沉默,通过流逝细胞仪的方法观察下游TNF-α、IL、IL22的表达情况,并记录HacaT的增殖情况。 结果： 生物信息学分析显示可能参与调控五个易感基因的miRNAs有42个,其中与HLA-Cw6相关的miRNAs有11个；并采用cytoscape软件绘制出基因-miRNA网络调控图(miRNA-Gene-Ne).外源性细胞实验重,经过多次验证,得到miR-222、miR-3188、miR-3162、miR-18b荧光素酶活性下调最为显著,随后进行的突变型荧光素酶报告载体进行共转染中,证实miR-149、miR-18b可直接调控HLA-CW6基因。最后,将miR-149、miR-18b在HacaT细胞中转染后,两者对HaCaT细胞都有抑制效果,其中miR-149的抑制效果更强,且随着作用时间的增强,细胞抑制率提高,同时miR-149对细胞因子TNF-α、IL8、IL22的分泌水平均有一定的抑制作用,而miR-18b则抑制作用较弱,仅对TNF-α抑制作用较明显。 结论： 1.通过生物信息学分析,建立绘制出基因-miRNA网络调控图,初步预测miRNAs可能通过调控易感基因的表达而调控银屑病的发病及病情进展过程。 2.通过双荧光素酶检测,得到miR-149、R-18b荧光素酶活性下调最为显著,证实了miRNAs可靶向调控HLA-CW06,进而推测miRNAs可能通过调控HLA-Cw6来调控银屑病发病、病情进展。 3.通过HaCaT细胞培养,miR-149、miR-18b进行转染,发现miR-149可以使人类永生化细胞产生明显的细胞活力抑制,同时对细胞因子TNF-α、IL8、IL22的表达均有一定的抑制作用,证实了miR-149对银屑病发病及病情进展的作用机制可能与细胞因子有关。而miR-18b则对细胞活力抑制较弱,并且对IL8、IL22的分泌水平无明显下调作用,其作用机制需进一步研究。 4.研究结果显示某些miRNAs和其易感基因之间存在某种网络样的调控机制,因此我们推测银屑病的miRNAs-易感基因-细胞因子之间可能存在着一个大的调控网络,并通过整个网络对银屑病的发病、病情演变形成调控,为下一步开展对银屑病基因层面治疗提供了新的思路及线索。
【关键词】：银屑病 MicroRNAs 易感基因 HLA-Cw6 细胞因子
【学位授予单位】：湖南中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R758.63
【目录】：

• ~.略词表4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 引言12-16
• 第一部分 寻常型银屑病差异性表达miRNAs与易感基因的相关性研究16-33
• 前言16-17
• 1. 材料17-18
• 1.1 设备17
• 1.2 预分析的靶基因17
• 1.3 预分析的miRNA17-18
• 2. 方法18-21
• 2.1 数据库18
• 2.2 登录数据网站,输入靶基因,搜索预测的miRNA。如图18-19
• 2.3 HLA-CW06的miRNA预测19-21
• 3. 结果21-28
• 3.1 易感基因的靶miRNA预测21-25
• 3.2 通过3.1的数据分析,我们获得了备选miRNA与易感基因的作用关系图表25-28
• 4 分析与讨论28-33
• 第二部分 体外细胞实验重点验证相关MiRNA与HLA-Cw6的相关性33-58
• 前言33-34
• 1 材料与方法34-45
• 1.1 实验材料34-36
• 1.2 实验方法36-45
• 2 结果45-54
• 3 分析与讨论54-58
• 第三部分 miRNA对细胞增殖及细胞因子分泌的影响58-71
• 前言58-59
• 1. 材料59-60
• 2. 方法60-65
• 3. 结果65-68
• 4 分析与讨论68-71
• 结论71-72
• 致谢72-73
• 参考文献73-80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 于世荣;普雄明;;T细胞活化因子与银屑病[J];中国麻风皮肤病杂志;2008年03期

2 赵奎;庞全海;;MicroRNA研究进展[J];生物技术通报;2010年12期

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本文编号：761798