脂筏在β1整联蛋白介导的恶性黑色素瘤细胞铺展中的作用及机制研究

发布时间：2017-09-05 08:06

  本文关键词：脂筏在β1整联蛋白介导的恶性黑色素瘤细胞铺展中的作用及机制研究

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【摘要】：肿瘤细胞自身的迁移性运动在肿瘤转移的各个阶段扮演了至关重要的角色。体内研究表明，肿瘤细胞必须与胞外基质相互作用，才能突破致密的组织屏障，最终迁移到新的组织器官。体外研究表明，应答于胞外基质，肿瘤细胞发生有效的黏附和铺展是其迁移进程中的基本事件，这依赖于整联蛋白介导的细胞-基质相互作用。通过与胞外基质的相互作用及由此所引发的簇集，整联蛋白诱发了初始黏着斑的形成，并将胞外基质和细胞骨架有效连接。但是，整联蛋白自身功能的发挥受到多种因素的调节。 脂筏是细胞膜上一类富含胆固醇和鞘脂类的液态有序微区结构。通过选择性的排除或包含一些蛋白，脂筏为蛋白-蛋白、蛋白-脂或脂-脂之间的相互作用提供了一个时空平台。脂筏的结构和功能特点使其近年来一直处于细胞膜研究的前沿，而且其在细胞运动中的作用机制已经引起许多研究者的关注。报道也已经显示，脂筏是包括整联蛋白在内的多种与细胞迁移相关的膜受体排布和功能的关键调节者。但是，脂筏在整联蛋白介导的肿瘤细胞黏附和铺展中的作用及机制并不清楚。 在本研究中，我们证明，脂筏的完整性对于β1整联蛋白介导的黑色素瘤A375细胞在纤黏连蛋白fibronectin上的铺展是关键的。我们流式细胞仪的结果显示，β3和β1整联蛋白均高表达于恶性黑色素瘤A375细胞表面。通过细胞黏附和铺展试验，我们发现，β3整联蛋白主要介导A375细胞在fibronectin上的黏附，而β1整联蛋白主要介导A375细胞在fibronectin上的铺展；用MβCD扰乱脂筏阻抑了β1整联蛋白介导的A375细胞在fibronectin上的铺展而不是β3整联蛋白介导的A375细胞黏附。通过免疫荧光双标记，我们发现，β1整联蛋白的簇集依赖于脂筏的完整性，脂筏的扰乱导致β1整联蛋白介导的黏着斑形成和肌动蛋白骨架重排的受阻。进一步，我们利用免疫共沉淀和脂筏成份分离试验，探讨了脂筏调控β1整联蛋白簇集的相关机制，发现完整的脂筏能够富集和修饰一些与整联蛋白簇集密切相关的接头蛋白（talin、α-actinin、vinculin、paxillin和FAK）。脂筏可能调节了这些接头蛋白在脂筏级份中的定位，便利了它们到β1整联蛋白尾部的募集。最后，利用transwell和wound healing模型，我们发现脂筏的扰乱显著阻抑了A375细胞的迁移。我们的研究揭示，扰乱脂筏可能是干预和治疗β1整联蛋白介导的恶性肿瘤转移的一种有效策略。
【关键词】：黑色素瘤细胞铺展 脂筏 β1整联蛋白簇集 黏着斑 接头蛋白
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 英文缩略词8-11
• 引言11-32
• 一、整联蛋白概述12-19
• （一）整联蛋白的发现和结构12-13
• （二）整联蛋白的配体及分类13-14
• （三）整联蛋白的功能14-16
• （四）整联蛋白与肿瘤细胞迁移16-17
• （五）整联蛋白行为的调节17-19
• 二、脂筏概述19-24
• （一）脂筏模型的提出19-20
• （二）脂筏结构的动态变化20-22
• （三）脂筏的功能22-23
• （四）脂筏与整联蛋白介导的细胞黏附和迁移23-24
• （五）脂筏与疾病24
• 三、黏着斑概述24-30
• （一）黏着斑的发现、成分和分类24-26
• （二）黏着斑动态变化的调节26-28
• （三）黏着斑在细胞迁移中的作用28-30
• 四、本论文研究的目的和意义30-32
• 实验材料与方法32-43
• 一、实验材料32-37
• （一）细胞32
• （二）抗体32-33
• （三）试剂33
• （四）siRNA 序列33-34
• （五）主要仪器及设备34
• （六）主要溶液34-37
• 二、实验方法37-43
• （一）细胞培养37
• （二）细胞转染37-38
• （三）细胞静止黏附与铺展实验38
• （四）层流检测38
• （五）细胞迁移实验38-39
• （六）免疫荧光标记和共聚焦显微镜39
• （七）流式细胞仪分析39-40
• （八）免疫共沉淀40
• （九）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳40-41
• （十）免疫印迹41
• （十一）脂筏提取和点杂交41-43
• 实验结果与分析43-62
• 一、β1 和β3 整联蛋白在 A375 细胞黏附和铺展中具有不同的功能43-46
• 二、脂筏对 A375 细胞黏附和铺展行为的影响46-50
• 三、A375 细胞黏着斑的初始形成依赖于脂筏调控的β1 整联蛋白簇集50-54
• 四、脂筏与β1 整联蛋白共簇集于 A375 细胞的突出边缘54-56
• 五、脂筏为β1 整联蛋白募集各种接头蛋白提供了时空平台56-59
• 六、脂筏扰乱削弱了 A375 细胞的迁移59-62
• 讨论62-66
• 一、β1 和β3 整联蛋白在 A375 细胞黏附和起始铺展中扮演不同的角色62-63
• 二、脂筏通过调节β1 整联蛋白的簇集控制黏着斑的形成63-64
• 三、脂筏富集和磷酸化接头蛋白，调控它们与β1 整联蛋白的相互作用64-66
• 参考文献66-77
• 结论77-78
• 创新点78-79
• 致谢79-80
• 在学期间公开发表论文情况80

【共引文献】

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本文编号：796793