Stevens-Johnson综合征与中毒性表皮坏死松解症中细胞毒蛋白的表达及意义

发布时间：2017-09-08 03:23

  本文关键词：Stevens-Johnson综合征与中毒性表皮坏死松解症中细胞毒蛋白的表达及意义

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【摘要】：Stevens-Johnson综合征（Stevens-Johnson Syndrome，SJS）与中毒性表皮坏死松解症（Toxci Epidermal Necrolysis，TEN）是一种以表皮大面积剥脱坏死、黏膜受累为主要表现的药源性疾病。其病情变化迅速，皮损泛发全身，常伴有发热及肝肾功能损害，死亡率较高（30%）。 关于SJS与TEN的发病机制尚不清楚，近年来的研究发现，SJS与TEN同属变态反应中的ⅣC型，此型变态反应的主要特点是通过特异性的抗原激活具有杀伤作用的CTL细胞，该细胞释放细胞毒性蛋白诱导靶细胞的坏死与凋亡。 细胞毒蛋白是一类由CD8~+T、NK、NKT细胞分泌的一类具有细胞毒作用的蛋白质，研究证实细胞毒蛋白如颗粒酶素B(Granzyme-B)，颗粒溶素（Granulysin），穿孔素（Perforin）等可通过不同的作用机理诱导表皮细胞的凋亡或坏死。可溶性人相关因子凋亡配体(soluable Fas Ligand, sFasL)在这个过程中亦具有重要作用，CTL细胞识别靶细胞后，细胞表面表达的高水平FasL与靶细胞表面的Fas相互识别，通过Fas触发靶细胞内部的Caspase-3系统，使靶细胞发生程序性死亡。穿孔素的作用是在靶细胞膜上形成多聚穿孔素管状通道，导致靶细胞溶解破坏，同时，该通道还可以使一些颗粒分子如Granulysin，Granzyme-B进入靶细胞内，对胞内感染发挥免疫作用。 Granulysin是近年来研究较多的一类细胞毒蛋白，在机体免疫应答过程中,在CTL增殖活化约3-5天后，Granulysin与Perforin和Granzyme-B等颗粒分子一起排出胞外,参与抗菌、抗病毒和杀伤肿瘤细胞等免疫过程。尽管有学者认为sFasl和Perforin是导致患者表皮细胞大量坏死凋亡的主要效应分子，然而这两种分子在SJS和TEN患者血清中的表达水平很低，人们很难理解如此低浓度的分子如何导致表皮细胞的大量凋亡和坏死，并且sFasL发挥作用时需要T细胞与靶细胞直接接触，而在SJS和TEN患者表皮内早期浸润的T细胞并不多。有台湾学者通过比较SJS和TEN患者与其他疱病患者疱液中颗粒溶素的表达水平，发现颗粒溶素在SJS和TEN疱液的浓度显著升高；并且通过免疫组织化学染色的方法，作者在SJS和TEN患者证实颗粒溶素可沉积在患者表皮；将颗粒溶素注入小鼠的表皮内，发现其可诱导小鼠表皮水疱的产生。 既然细胞毒蛋白在中毒性表皮坏死松解症表皮坏死过程中中具有重要作用，那么它们与患者的临床表现是否存在内在联系呢？而且在中毒性表皮坏死松解症早期的发病中，患者往往仅表现为红斑丘疹，与斑丘疹型药疹鉴别困难，细胞毒蛋白水平是否有可能作为鉴别二者的分子标记呢？因此，我们决定以细胞毒蛋白为研究对象，通过观察SJS和TEN患者体内细胞毒蛋白的表达水平及产生细胞毒蛋白的细胞来源，为鉴别早期SJS、TEN与斑丘疹型药疹提供依据，并分析其水平与临床指标的关系，为患者的治疗与预后提供判定依据。 目的 以SJS与TEN患者的血清与外周血单个核细胞为研究对象，研究细胞毒蛋白在SJS与TEN患者体内的表达水平及细胞来源，并分析其临床意义，为阐明SJS与TEN的发病机制以及为其早期诊断和鉴别诊断提供可靠的实验室依据。 方法 纳入研究的对象均为西京皮肤医院住院患者，其中TEN患者7例，SJS患者8例，男性患者8名，女性患者7名，年龄为14～51岁，，平均年龄28岁，病程0～9d，致敏药物为抗生素类5例，抗癫痫类药物4例，非甾体抗炎药6例。普通型药物反应患者15例，包括多形红斑型（erythema multiforme，EM）药疹患者7例，斑丘疹型药疹(maculopapular exanthema,MPE)患者8例，其致敏药物分别为阿莫西林、青霉素、对乙酰氨基酚、卡马西平及氨基比林等药物。选取10名健康人作为健康对照。其中男5例，女5例，来自本院体检中心，年龄与性别与患者组相比均无统计学差异。 首先分离患者血清及外周血单个核细胞，利用ELISA和流式细胞术分析其细胞毒蛋白的表达水平，分析其水平与临床指标的相关性，并利用流式细胞术鉴定产生CD8~+T细胞的来源。 其次利用流式细胞仪分选3名长期好转的SJS与TEN患者CD8~+的记忆性T细胞，与致敏药物和其B淋巴母细胞共孵育，利用CCK8检测每个细胞群增殖情况。 结果: 中毒性表皮坏死松解症患者血清颗粒溶素水平为0.269±0.138ng/ml，明显高于多形红斑药疹组（0.05+0.006ng/ml），MPE组（0.02+0.003ng/ml）及正常对照组（0.01+0.005ng/ml），（P0.05），进展期中毒性表皮坏死松解症患者CD8~+T细胞选择性表达颗粒溶素。穿孔素在中毒性表皮坏死松解症的表达水平高于EM组，而与MPE组相比无明显统计学差异。颗粒酶素B在中毒性表皮坏死松解症患者CD8阳性T细胞表达水平明显低于普通药疹患者，在血清水平与其他对照组差别无统计学意义。可溶性人相关因子凋亡配体的血清浓度在中毒性表皮坏死松解症中明显高于其他对照组。细胞内的Granulysin水平与CK-MB水平呈正相关（P=0.0186，r=0.617），细胞中的Granulysin与CK水平呈正相关（P0.001，r=0.79），而与白球蛋白比值、AST、ALT等指标均无相关性。 通过流式细胞仪技术我们发现产生细胞毒蛋白的细胞为CD8阳性的效应性T细胞和效应记忆性T细胞，在体外实验中，我们发现在致敏药物的刺激下，效应记忆性T细胞增殖最快。 结论: 中毒性表皮坏死松解症患者体内细胞毒蛋白的水平可能与其疾病的严重程度相关，其中颗粒溶素在中毒性表皮坏死松解症患者中的表达相对特异，可作为鉴别中毒性表皮坏死松解症与普通型药疹的分子标记，其表达水平还可能与患者的心肌损伤有关。 产生细胞毒蛋白的CD8~+T细胞来源于效应性T细胞与效应记忆性T细胞。在致敏药物的刺激下，这两群细胞可发生增殖，效应记忆性T细胞的增殖速度最快，从而在中毒性表皮坏死松解症的发病过程中发挥重要作用。
【关键词】：Stevens-Johnson综合征 中毒性表皮坏死松解症 颗粒溶素 颗粒酶素B 穿孔素 记忆性T细胞
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R758.25
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-12
• ABSTRACT12-16
• 前言16-17
• 文献回顾17-27
• 1. 中毒性表皮坏死松解症的定义及分类17
• 2. 流行病学特征17
• 3. 临床特点17-18
• 4. 发病机制18-27
• 4.1 药物与遗传易感性18-19
• 4.2 特定的 T 细胞表面抗原受体序列发挥作用19
• 4.3 细胞毒蛋白的分类及诱导表皮细胞凋亡的作用机制19-22
• 4.4 单核、巨噬细胞所发挥的促凋亡作用22-23
• 4.4.1 TNF-α22-23
• 4.4.2 TNF-α相关的凋亡诱导配体与 TNF-α相似的凋亡诱导分子23
• 4.4.3 调节性 T 细胞的作用23
• 4.5 T 细胞的活化增殖以及记忆性 T 细胞的形成23-27
• 4.5.1 T 细胞的活化增殖与转归23-24
• 4.5.2 CD8 记忆性 T 细胞的分类及形成过程24-27
• 引言27-28
• 研究对象28-30
• 材料30-33
• 1.主要仪器设备30-31
• 2.主要试剂31-32
• 3.主要试剂的配制方法32-33
• 实验一 检测中毒性表皮坏死松解症患者体内细胞毒蛋白水平33-47
• 1 方法33-35
• 1.1 病例搜集33
• 1.2 入选标准33
• 1.3 ELISA 检测细胞毒蛋白水平33-34
• 1.4 流式细胞仪检测细胞内细胞毒白水平34-35
• 1.4.1 SJS、TEN 患者外周血单个核细胞的分离：34
• 1.4.2 利用流式细胞分析仪分析细胞水平中细胞毒蛋白的表达34-35
• 1.4.3 分析细胞毒蛋白与患者临床指标的相关性35
• 2 结果35-45
• 2.1 SJS、TEN 患者血清内细胞毒蛋白的水平35-38
• 2.1.1 SJS、TEN 患者血清中 Granulysin 的表达水平35-36
• 2.1.2 SJS、TEN 患者血清中 Granzyme-B 的表达水平36
• 2.1.3 SJS、TEN 患者血清中 sFasl 的表达水平36-37
• 2.1.4 SJS、TEN 患者血清中 Perforin 的表达水平37-38
• 2.2 细胞中细胞毒蛋白的表达38-41
• 2.2.1 CD3~+CD4~+T 与 CD3~+CD8~+T 细胞中 Granulysin 的表达38-39
• 2.2.2 细胞水平 Granzyme-B 的表达39-40
• 2.2.3 细胞水平 Perforin 的表达40-41
• 2.2.4 比较 SJS 与 TEN 患者 Granulysin 水平41
• 2.3 细胞毒蛋白与临床指标的相关性分析41-43
• 2.4 细胞毒蛋白在激素治疗前后的水平变化43-45
• 2.5 统计学分析45
• 3 讨论45-47
• 3.1 细胞毒蛋白水平与药疹的严重程度有关45-46
• 3.2 Granulysin 可作为鉴别急性期 SJS 和 TEN 患者与普通型药疹患者的分子标记46
• 3.3 Granulysin 的水平可能与部分患者心肌损伤相关46-47
• 实验二 细胞毒蛋白的 CD8~+T 细胞的来源47-54
• 1 方法47-48
• 1.1 样本收集47
• 1.2 SJS 与 TEN 患者外周血单个核细胞分离47
• 1.3 鉴定细胞毒蛋白的 CD8~+T 细胞的来源47-48
• 1.3.1 流式细胞术分析产生细胞毒蛋白 CD8~+T 细胞来源47-48
• 1.3.2 淋巴细胞增殖实验48
• 2 结果48-52
• 2.1 流式细胞仪鉴定细胞毒蛋白的细胞来源48-50
• 2.2 B 淋巴母细胞系的建立50
• 2.3 不同 T 细胞亚群的分选50-51
• 2.4 不同 T 细胞亚群在致敏药物刺激下增殖活性51-52
• 3 讨论52-54
• 3.1 分泌细胞毒蛋白的 CD8~+T 细胞是效应性 T 细胞和效应记忆性 T 细胞52-53
• 3.2 CD8~+效应记忆性 T 细胞长期存活于中毒性表皮坏死松解症患者体内，并可再次增殖活化53-54
• 小结54-55
• 参考文献55-63
• 个人简历和研究成果63-64
• 致谢64-65

【引证文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 马雪燕;高华;;Stevens-Johnson综合征和中毒性表皮松解症的病理损害、眼部表现及治疗进展[J];国际眼科纵览;2016年01期

2 毕津莲;陈艳;张秀芹;邹渭洪;;芳香族抗癫痫药物致皮肤不良反应的研究进展[J];中国现代医学杂志;2015年33期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 邱建文;重症药疹69例临床回顾性分析[D];昆明医科大学;2015年

本文编号：811587