白念珠菌分泌的诱导人单核细胞凋亡新因子的初步纯化和鉴定

发布时间：2017-09-14 01:13

  本文关键词：白念珠菌分泌的诱导人单核细胞凋亡新因子的初步纯化和鉴定

  更多相关文章： 白念珠菌 THP-1细胞 SIIF 细胞增殖 抗真菌感染

【摘要】：目的：本研究我们将观察从白念珠菌培养上清液中分离到的一种新型毒力因子分泌型IL-12抑制因子（Secretary IL-12Inhibitory Factor，SIIF）对人类单核细胞增殖率的影响和诱导凋亡情况，检测其诱导凋亡活性。观察SIIF蛋白结合于人类单核细胞的部位。明确SIIF的蛋白序列和基因序列，筛选出可疑蛋白，有助于后期SIIF蛋白作用机制的研究及将来有可能采取特异性干扰SIIF蛋白活性的治疗方案来控制局部及系统性的白念珠菌感染。方法：白念珠菌菌株选自前期试验中收集念珠菌性阴道炎（vulvovaginal candidiasis, VVC）患者阴道分泌物经直接镜检、接种培养形态学鉴定及提取DNA检索基因组数据库均鉴定为白念珠菌的菌株。人类单核细胞选用人急性单核细胞白血病细胞系（The Human acutemonocytic leukemia cell line, THP-1）。将选定的白念珠菌接种于含有20mlRPMI1640培养液的离心管中，置于37度恒温振荡培养箱中振荡培养，经两次纯化后接种于含有500mlRPMI1640液体培养基烧瓶中，继续37度恒温振荡培养箱培养24小时，培养后收集培养上清液，分装入离心管中离心除去白念珠菌，，离心后的上清液经除菌滤过器（0.22μm）再次除菌，将培养上清液加入Centricon-70蛋白浓缩器（截留分子量大于30KDa的蛋白分子）中离心浓缩得到SIIF蛋白，BCA法测定蛋白浓度后-80度保存备用。实验根据是否在培养的人单核细胞中加入SIIF蛋白分为实验组和对照组，实验组SIIF蛋白终浓度为400μg/ml。SIIF蛋白与THP-1细胞共同培养24小时后GENMED XTT法分别检测实验组和对照组450nm波长处吸光度值并根据吸光度值计算出实验组相对对照组细胞增殖率；AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪(Flow cytometry，FCM）分别检测实验组和对照组THP-1细胞早期凋亡率；ConA-FITC/DAPI双染法荧光显微镜观察SIIF蛋白结合于细胞部位；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离纯化SIIF蛋白，电泳后的SDS-PAGE条带经胰蛋白酶酶解后进行液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography tandem massspectrometric，LC-MS/MS）分析，然后采用Mascot软件检索NCBInr数据库获得与肽段匹配的相关蛋白及其基因序列，最后根据蛋白分子量大小、评分及相关功能综合评价筛选出可疑蛋白。测得的THP-1细胞增殖率及细胞早期凋亡率应用SPSS17.0软件包进行统计分析。结果：1.GENMEDXTT法检测显示SIIF蛋白作用于THP-1细胞24小时后，450nm处吸光度值明显低于对照组，实验组相对对照组细胞增殖率也明显低于对照组，与对照组细胞增殖率相比较差异具有统计学意义（P=0.0260.05）。2.AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测显示SIIF蛋白作用于THP-1细胞24小时后，实验组细胞早期凋亡率为（11.867±1.604）%，明显高于对照组（5.300±0.265）%，与对照组早期凋亡率相比较差异具有显著性意义（P=0.0020.01）。3.ConA-FITC/DAPI双染荧光显微镜观察显示，SIIF蛋白所在位置的绿色荧光与DAPI所在细胞核位置的蓝色荧光完全重合，说明SIIF蛋白进入THP-1细胞后结合于细胞核。4.SIIF蛋白经SDS-PAGE分离、胰蛋白酶酶解及液相色谱-串联质谱法分析后，根据蛋白分子量大小、评分及功能综合评价后，我们将分泌型天冬氨酸蛋白酶6（Secretedaspartyl proteinase，Sap6）和Rbt4p（repressed by TUP1protein4）两种蛋白作为SIIF候选蛋白。结论：1.SIIF蛋白能抑制THP-1细胞增殖。2.SIIF蛋白具有诱导THP-1细胞凋亡的活性。3.SIIF蛋白进入THP-1后结合于细胞核，可能通过影响细胞DNA转录，功能蛋白合成受阻，使细胞活性下降，最终细胞发生凋亡。4.Sap6和Rbt4p为候选的SIIF蛋白。
【关键词】：白念珠菌 THP-1细胞 SIIF 细胞增殖 抗真菌感染
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R756
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-15
• 材料与方法15-27
• 结果27-36
• 讨论36-41
• 结论41-42
• 参考文献42-46
• 英汉缩略词对照表46-48
• 致谢48-49
• 抗系统性白念珠菌感染的先天性免疫（综述）49-61
• 参考文献57-61

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 邵先安;;淋巴细胞对白念珠菌的粘附[J];国外医学(微生物学分册);2002年04期

2 张军民,王汉平,鲁长明,席丽艳,曾凡钦;白念珠菌基因微卫星多态性与分型探讨[J];中国麻风皮肤病杂志;2002年01期

3 苑天红,王明永,吴升伟,吴承龙;小鼠腹腔吞噬细胞对二相性白念珠菌的吞噬研究[J];贵阳医学院学报;2004年04期

4 苑天红,王明永,吴升伟,吴承龙;甘露糖在介导二相性白念珠菌粘附中的重要作用[J];中国人兽共患病杂志;2004年11期

5 苑天红,王明永,吴升伟,王正蓉,吴承龙;白念珠菌二相性与毒力关系的实验研究[J];中国皮肤性病学杂志;2004年10期

6 李丰霞,张宏,巢和安,谢明;氟康唑联合乙醇抗白念珠菌活性的体外实验研究[J];中国皮肤性病学杂志;2005年10期

7 朱利平,章强强,龚华斐,李莉,翁心华,王家俊,张永信;都柏林念珠菌和白念珠菌分子指纹图谱差异性分析[J];中华传染病杂志;2005年04期

8 苑天红,王明永,吴升伟,王正蓉,吴承龙;白念珠菌二相性与致病性关系[J];中国公共卫生;2005年01期

9 马黎;席丽艳;;都柏林念珠菌和白念珠菌的致病性比较研究进展[J];中国麻风皮肤病杂志;2006年02期

10 黄杉;曹颖瑛;姜远英;;白念珠菌基因中断技术研究进展[J];第二军医大学学报;2006年05期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 王冬云;谭升顺;马慧群;马韵琴;陈庆秀;;白念珠菌的毒力研究——分泌性酸性蛋白酶活力的测定[A];2001年中国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2001年

2 满旭;王惠平;;白念珠菌转录因子编码基因表达与氟康唑耐药的关系[A];中华医学会第十八次全国皮肤性病学术年会论文汇编[C];2012年

3 黄广华;;白念珠菌有性生殖、形态发生及毒性的进化[A];中国菌物学会第五届会员代表大会暨2011年学术年会论文摘要集[C];2011年

4 王慧;徐宁;喻其林;程欣欣;邢来君;李明春;;钙细胞存活途径与白念珠菌的致病性[A];中国菌物学会第五届会员代表大会暨2011年学术年会论文摘要集[C];2011年

5 阎澜;李妙海;曹永兵;高平挥;王彦;姜远英;;白念珠菌耐药新蛋白——交替氧化酶[A];药学发展前沿论坛及药理学博士论坛论文集[C];2008年

6 郭仁勇;;白念珠菌聚苯乙烯黏附增强基因1的研究进展[A];2008年浙江省检验医学学术年会论文汇编[C];2008年

7 ;线粒体功能在不同环境对白念珠菌生存及代谢的影响[A];2012年中国菌物学会学术年会会议摘要[C];2012年

8 曾跃斌;;白念珠菌全基因组表达谱芯片在抗真菌药物研究中的应用[A];中国药理学会第十一届全国化疗药理学术研讨会论文集[C];2012年

9 周万青;沈瀚;张之烽;张葵;;白念珠菌临床分离调查及基因分型研究[A];中华医学会第七次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2012年

10 景伟芳;王惠平;;白念珠菌对唑类药物耐药机制的研究进展[A];中华医学会第十五次全国皮肤性病学术会议论文集[C];2009年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 国虹 雨净;微生物的是是非非[N];中国教育报;2001年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 刘泽虎;白念珠菌形态、胞壁多糖的结构及其免疫学活性的相关研究[D];中国协和医科大学;2009年

2 唐宁枫;白念珠菌烯醇化酶的研究[D];中国协和医科大学;2000年

3 王平;阴道念珠菌菌种及香莲方逆转白念珠菌耐药基因组学研究[D];广州中医药大学;2013年

4 许懿;小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌的作用机制研究[D];第二军医大学;2010年

5 李彩霞;阴道细菌群落多样性及外阴阴道念珠菌病相关白念珠菌基因多态性研究[D];北京协和医学院;2013年

6 王乐;小鼠口腔阴道双部位白念珠菌感染模型的构建及不同部位来源白念珠菌的毒力差异研究[D];北京协和医学院;2014年

7 曾跃斌;特比萘芬对白念珠菌的药理作用及诱导耐药机制研究[D];汕头大学;2007年

8 梁晓博;白念珠菌敏感株对氟康唑产生适应性突变耐药的研究[D];第二军医大学;2000年

9 徐铮;白念珠菌基因芯片的制备和应用及两个新基因的克隆和功能鉴定[D];第二军医大学;2005年

10 阎澜;白念珠菌耐药性产生的“线粒体氧化呼吸抑制”机制[D];第二军医大学;2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 刘乐;不同培养条件对白念珠菌芽管形成的影响[D];兰州大学;2008年

2 阎澜;白念珠菌耐药株的蛋白质组与基因表达谱分析及差异蛋白质与差异基因的识别鉴定[D];第二军医大学;2006年

3 秦晓峰;白念珠菌临床株耐药基因表达与氟康唑耐药的关系[D];第二军医大学;2006年

4 许懿;小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌作用的蛋白质组学研究[D];第二军医大学;2007年

5 钟毅;白念珠菌苹果酸脱氢酶的结构及功能初步研究[D];中山大学;2012年

6 张蕾;紫外线对白念珠菌生长的影响[D];福建医科大学;2012年

7 郭雅莉;白念珠菌多位点序列分型研究[D];天津医科大学;2012年

8 满旭;白念珠菌锌簇转录因子编码基因表达与氟康唑耐药的关系[D];天津医科大学;2013年

9 吴海棠;整合非靶标和靶标代谢组学模式的白念珠菌被膜形成及药物干预机制研究[D];第二军医大学;2013年

10 李蕾;白念珠菌天冬氨酸蛋白酶2真核表达载体的构建及原核表达[D];中国人民解放军军医进修学院;2009年

本文编号：846989