上皮—间充质转化在银屑病中的研究

发布时间：2017-09-19 16:36

  本文关键词：上皮—间充质转化在银屑病中的研究

  更多相关文章： 上皮间质转化 银屑病 E-cadherin Vimentin 角质形成细胞

【摘要】：研究背景上皮-间充质转化(EMT)是一种胚胎时期出现过的一个基本过程,同时也是伤口愈合、器官纤维化以及恶性上皮肿瘤发生的基础。研究EMT对于认识和理解炎症性疾病发生、发展的病理生理机制都有十分重要的意义。银屑病是以表皮过度增殖、血管内皮异常增生和淋巴细胞浸润为特征的慢性炎症性皮肤病。表皮角质形成细胞在增殖和迁移中表型转变,其抗凋亡、迁移能力显著提升,这个过程类似于上皮-间充质转化的过程,为了进一步证实猜想,我们开展了这个课题的研究。目的明确EMT相关分子标志物在皮肤角质形成细胞及皮肤组织中的定位；明确EMT相关分子标志物在正常皮肤组织及体外培养角质形成细胞中的表达量；阐明EMT相关分子标志物在银屑病中表达的相关调控因素；EMT相关分子标志物在银屑病发生发展中的作用机制。方法获取来自银屑病病人皮肤样本,并进行角质形成细胞原代培养。免疫荧光及免疫组化法研究EMT相关分子标志物在银屑病皮肤组织及细胞的定位。提取组织及细胞的RNA和蛋白质,进行定量PCR、免疫印迹实验,分析EMT相关分子标志物的表达量。经银屑病相关细胞因子处理,进一步观察EMT相关分子标志物不同细胞因子处理下在银屑病角质形成细胞中的表达差异。经ERK、Rho和GSK3的抑制剂分别处理以及与地塞米松联合处理,以此观察EMT相关分子标志物在银屑病发生发展中的作用机制。结果正常皮肤及银屑病皮肤样本中上皮间质转化分子标志物的表达1.上皮细胞分子标记物E-cad和β-catenin在正常表皮和银屑病表皮全层中均有表达；K10和K16定位于表皮层棘层以上,正常和银屑病表皮中定位无明显差异。K14在正常表皮中定位于基底及基底上层,而在银屑病表皮中则定位于表皮全层。2.在正常和银屑病真皮中均没有上皮分子标志物E-cad,K10,K14和K16的表达。3.在正常表皮中没有间质分子标志物Vim, Snail, Slug, FN和N-cad的表达。4.在银屑病表皮中,间质细胞分子标志物Vim, Snail, Slug和FN大量表达,N-cad中等量表达。1.体外培养正常和银屑病角质形成细胞中上皮间质转化分子标志物RNA和蛋白水平1.与正常角质形成细胞相比,银屑病角质形成细胞中上皮间质转化分子标志物转录组测序水平为K10下调,Vim,FN,PAI-1和Snail RNA水平上调,E-cad,K14, K16,N-cad,β-catenin和Slug没有明显差异。2.正常和银屑病角质形成细胞中,Vim, FN和PAI-1 mRNA水平有显著差异(P0.01),而E-cad,K10,K14,K16,N-cad,β-catenin,Snail和Slug mRNA水平无统计学差异。3.正常和银屑病角质形成细胞中,Vim,FN和PAI-1蛋白水平有显著差异。2.银屑病角质形成细胞中上皮间质转化分子标志物的调控机制1.上皮分子标志物E-cad在TNF-a作用下表达略微升高,K10在IL-8,TGF-β1,IL-13,尤其是IL-17A和TNF-α的作用下表达显著下调。K14在IL-17A的作用下表达降低而TGF-β1对其作用相反,TGF-β1也使N-cad表达显著上调。2.IL-17A和IL-13下调间质分子标志物Vim和FN mRNA水平,而TGF-β1则作用相反。3.TNF-α上调FN而下调Slug的表达,TGF-β1上调PAI-1,Snail在IL-17A作用下表达上调,而IL-8则促其下调。4.MAPK/ERK、Rho/ROCK和Wnt/GSK3信号通路在银屑病角质形成细胞EMT的作用1.Y27632阻断Rho,或SB216763阻断GSK3后均能引起E-cad,β-catenin和Slug RNA和蛋白水平的升高。2.单独使用地塞米松在0.2gM浓度时可使Slug下调而对E-cad和P-catenin无影响,在2μM浓度时引起E-cad表达升高和Slug的表达降低。3.地塞米松在0.2μM的浓度与Y27632共孵育时能明显抑制Y27632所引起的E-cad,β-catenin和Slug表达上调,但在其2μM浓度时只影响Y27632对β-catenin的影响。4.SB216763介导的E-cad过表达在地塞米松0.2μM和2μM浓度时均被抑制,而对β-catenin和Slug的影响则只有在地塞米松2gM浓度时则被抑制。结论1.表皮角质形成细胞的特征是上调间充质分子标志物Vim,FN和PAI-1,而上皮分子标志物E-cad,K10和K14并无明显变化。2.在银屑病EMT中,IL-17A和LI-13是负性调节因子,TGF-β1则是正性调节因子,TNF-a的作用多向性。3.ERK,Rho和GSK3信号通道参与银屑病角质形成细胞EMT过程,而地塞米松起保护作用。4.银屑病属于EMT的2型中间表型。
【关键词】：上皮间质转化 银屑病 E-cadherin Vimentin 角质形成细胞
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R758.63
【目录】：

• 致谢4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 本课题中使用到的主要仪器14-15
• 主要试剂的配制15-18
• 英文缩写注释18-22
• 1 前言22-25
• 2 材料与方法25-33
• 2.1 实验材料25
• 2.2 标本收集25-26
• 2.3 表皮角质形成细胞(KC)原代培养26
• 2.4 RNA提取,逆转录及实时荧光定量PCR26-27
• 2.5 免疫荧光法27-28
• 2.6 免疫组化法28
• 2.7 免疫印迹(western blot)28-32
• 2.8 统计学分析32-33
• 3 结果33-46
• 3.1 正常皮肤及银屑病皮肤样本中上皮间质转化分子标志物的表达33-36
• 3.2 体外培养正常和银屑病角质形成细胞中上皮间质转化分子标志物RNA和蛋白水平36-38
• 3.3 银屑病角质形成细胞中上皮间质转化分子标志物的调控机制38-41
• 3.4 MAPK/ERK、Rho/ROCK和Wnt/GSK3信号通路在银屑病角质形成细胞EMT的作用41-46
• 4. 讨论46-49
• 5 结论49-50
• 参考文献50-58
• 综述58-68
• 参考文献63-68
• 个人简历68

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