TNIP1蛋白在银屑病发病中的作用及机制研究

发布时间：2017-09-30 22:16

  本文关键词：TNIP1蛋白在银屑病发病中的作用及机制研究

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【摘要】：背景：寻常型银屑病(以下简称银屑病)临床常见、多发,病程慢性易反复,影响1-2%的欧洲和北美人群；中国人群患病率仅为0.47%,但人口基数大,仍有着相对庞大的人群受累。银屑病主要累及皮肤,表现为鳞屑、红斑、斑块,多伴瘙痒。与大部分皮肤病不同的是,银屑病患者伴发代谢综合征如血脂紊乱、高血压、心血管疾病等疾病的发病率高于正常人群。其具体发病机制不清,临床治疗手段有限,严重影响患者的生活质量,并给社会和患者家庭带来沉重的经济负担。家族聚集性研究(familial aggregaltion studies)证实银屑病会遗传,这是一个多基因遗传疾病,其发病模式不符合任何孟德尔遗传规律；我国流行病学调查资料显示28.43%的银屑病患者有家族史,远高于普通人群的2.23%。目前普遍认为银屑病是有基因易感性的个体在环境因素的影响下发展出来的炎症性皮肤病。近年来,随着全基因组关联分析(genome-wide association studies,GWAS)技术的大力开展,至少有36个不同的基因被先后鉴定为银屑病的易基因,而其中少数基因,如白介素-23(interleukin 23,IL-23)基因、IL-23受体(IL-23 receptor,IL-23R)基因和肿瘤坏死因子a诱导蛋白3的相互作用蛋白1(TNIP1)基因已经在多种族人群包括中国人群中被证实为银屑病的易感基因。对IL-23/IL-23R编码的细胞因子IL-23及其受体的研究,引出了一类特殊的T辅助细胞17(T helper 17,Th17)的发现和命名。Thl7细胞以分泌细胞因子IL-17为重要特征。勿庸置疑,目前以拮抗IL-17为主的生物制剂因其作用显著、副作用小为银屑病的治疗带来巨大变化,这充分说明致力于银屑病易感基因的生物学研究,对延伸GWAS的研究成果、解读银屑病发病机制、筛选新的银屑病生物治疗靶点均意义重大。TNIP1基因,作为中国汉族和欧洲人群所共有的另一个银屑病易感基因,其表达水平在银屑病皮损处比未受累皮肤和正常人皮肤均显著升高；除了银屑病,TNIP1亦被GWAS证实为系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE).肺癌和系统性硬化病(systemic sclerosis)等疾病的易感基因。TNIP1基因编码的TNIP1蛋白,与TNIP2.TNIP3同属于TNIPs家族,该家族因能与泛素编辑蛋白A20结合、并抑制核转录因子(nuclear factor-κB, NF-κB)的转录活性而得名,并因此获得另一个命名ABINs(A20-binding inhibitor of NF-κB)。目前已经证实TNIP1可不依赖于A20和NF-κB发挥作用,细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinasel/2, Erk1/2)、视黄酸受体-α/-γ (retinoic acid receptor-α/-γ, RAR-α/-γ)、过氧化物酶体增殖体激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)和CCAAT/增强子结合蛋白p(CCAAT/enhancer-binding protein β, C/EBPβ)等均被证实为TNIP1的靶目标,这些分子被TNIP1激活后可通过多条迥异的信号通路发挥不同的生物作用。目前关于RAR-α与TNIP1的研究较多。研究发现,TNIP1与RAR-α共存于人类头皮表皮细胞的同一亚细胞小室(subcellular compartment)中,这种共存模式为TNIP1/RAR-α相互作用提供了生理基础。在RAR-α被相应配体激活后,TNIP1作为RAR-α的协同抑制因子(corepressor)发挥相应的作用。因此,TNIP1被归属为与激动剂结合的核受体(nuclear receptor, NR)的协同抑制因子；而另一个NR的协同抑制因子,PRAME,已被证实与恶性肿瘤细胞对化疗药物维甲酸的敏感性有关。TNIP1是否与肿瘤细胞对化疗的敏感性有关,目前并无相关报道。除了皮肤,TNIP1蛋白还广泛分布于多种器官／组织和细胞中,如脑组织、心脏、肺、胃、肾脏、前列腺、胰腺、结肠等多种组织／器官均可见TNIP1蛋白表达。TNIP1主要表达于细胞胞浆,但在上皮细胞包括表皮细胞中,可同时见TNIP1的胞核分布和胞浆分布。TNIP1在上皮细胞胞核和胞浆之间的转移,被认为参与了RAR受体和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α, TNFα)受体信号通路。有意思的是,即使同为上皮组织起源,TNIP1蛋白在皮肤鳞癌(squamous cell carcinoma, SCC)的表达水平较正常组织显著升高,而前列腺腺癌组织TNIP1蛋白则显著丢失,提示TNIP1在不同组织起源的肿瘤组织中发挥不同甚至相反的作用。综上,我们有理由相信对TNIP1基因及其编码蛋白TNIP1在皮损局部的生物学作用进行研究可能会推动银屑病发病机制研究的进展。角质形成细胞作为表皮数量最多的优势细胞,在以角质形成细胞增殖分化异常为主要特征之一的银屑病相关研究中,一直占有重要地位。过度增殖的角质形成细胞可产生过量的抗菌肽(antimicrobial peptides and proteins, AMPs),其中cathelicidin/LL-37、β-defensins和S100蛋白被认为在银屑病发病机制中发挥重要调节作用。此外,AMPs被认为参与了银屑病皮损处的多种免疫反应,比如化学趋化因子、血管生成因子的合成；AMPs亦参与调节角质形成细胞的增殖。角质形成细胞显著异常,致银屑病表皮屏障功能严重受损,亦被认为参与了银屑病的发病过程。而2005年研究者们将小鼠表皮基底层细胞Jun蛋白敲除继而阻断转录因子激活蛋白-1 (transcription factorActivator Protein 1, AP-1)信号通路后,在小鼠皮肤上成功诱导出类似人类银屑病临床表现的皮肤炎症和关节炎,更是将角质形成细胞在银屑病致病机制中的作用推到了高处。人类JunB(19p13.2)是AP-1转录因子的组成成分之一,位于银屑病易感位点6(PSORS6)的位点(19p13)处；JunB蛋白表达于多种器官中,主要参与细胞增殖、分化、凋亡过程和调节细胞因子的合成。因此我们推测,以角质形成细胞为银屑病致病机制的研究对象,以细胞增殖、分化为研究的切入点是可行的。实验目的：以TNIP1调节角质形成细胞增殖为切入点探讨银屑病易感基因TNIP1在银屑病发病机制中可能的生物学作用以及机制研究。实验方法：(1)应用免疫组化(immunohistochemistry, IHC)、免疫印迹和实时定量逆转录多聚酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测银屑病表皮TNIP1蛋白和基因水平；(2)应用免疫荧光结合激光共聚焦检测HaCaT细胞内源性TNIP1蛋白表达情况,并检测自行分离培养的人原代角质形成细胞(primary human keratinocyte, PHK)全角蛋白AE1/AE3的表达情况；(3)设计、合成特异性抗TNIP1短发夹干扰RNA (small interfering hairpin RNA, shRNA)TNIP1 shRNA和重组TNIP1(recombinant TNIP1, rTNIP1),并以慢病毒为载体,分别感染角质形成细胞和BALB/c小鼠；(4)应用qRT-PCR和免疫印迹分别检测TNIP1 shRNA HaCaT/PHK细胞和rTNIP1 HaCaT/PHK细胞的TNIP1 mRNA水平和TNIP1蛋白水平；(5)应用活体小动物成像、免疫印迹分别检测BALB/c小鼠感染慢病毒后荧光表达情况和TNIP1蛋白水平,并用免疫组化检测局部IκBα、IL-lb、TNF-α和IL-1a等细胞因子表达水平；(6)应用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8, CCK8)=ELISA BrdU和免疫印迹检测细胞角蛋白6 (cytokeratin 6, CK6)水平分别评价角质形成细胞感染慢病毒后的增殖能力；(7)应用免疫印迹检测慢病毒感染角质形成细胞的Erk1/2水平和磷酸化Erk1/2 (phosphorylation of Erkl/2, p-Erkl/2)水平,并用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)研究在HaCaT细胞TNIP1是否与Erk1/2相互作用,(8)应用Erk1/2特异性抑制剂抑制Erk1/2磷酸化,再用免疫印迹检测慢病毒细胞的CK6蛋白水平；(9)应用免疫印迹检测慢病毒感染角质形成细胞的C/EBPβ水平；(10)构建、合成抗C/EBPβ的特异性小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),以抑制角质形成细胞的C/EBPβ水平,并用免疫印迹检测细胞的CK6蛋白水平；(11)采用咪喹莫特(imiquimod, IMQ)-诱导BALB/c小鼠银屑病样皮炎动物模型,对小鼠背部涂抹区域的红斑、鳞屑和皮肤粗糙、隆起情况进行评分、统计分析,并行皮肤组织组织病理检查,观察局部炎细胞浸润和角质形成细胞增殖情况。实验结果：(1)银屑病皮损表皮与正常皮肤比较,其TNIP1基因水平、CK6基因水平显著升局；TNIP1蛋白表达显著降低,而CK6蛋白表达显著增强。TNIP1蛋白水平降低可能参与了银屑病的发病。皮内注射慢病毒下调小鼠局部皮肤TNIP1蛋白水平后,会加剧IMQ诱导的小鼠银屑病样皮炎临床表现(红斑、鳞屑、皮肤隆起评分及总评分)提示TNIP1对银屑病样皮炎有保护作用；(2)通过检测CK6基因/蛋白水平、CCK8增殖实验、ELISA BrdU实验,一致证实HaCaT/PHK细胞增殖受TNIP1蛋白水平变化的调节。下调TNIP1表达导致细胞增殖增强,而上调TNIP1则抑制细胞增殖；(3)免疫共沉淀Co-IP证实HaCaT细胞TNIP1与Erk2相互作用。角质形成细胞的TNIP1水平上调后,其p-Erk1/2和C/EBPβ表达被抑制；TNIP1表达下调则导致角质形成细胞的p-Erk1/2和C/EBPβ表达增强。推测TNIP1可能通过Erk1/2和C/EBPβ调节角质形成细胞增殖。在TNIP1水平下调的前提下,分别抑制TNIP1 shRNA HaCaT细胞的p-Erk1/2或C/EBPβ水平后,会导致细胞CK6蛋白水平降低,推测TNIP1部分通过p-Erkl/2或C/EBPβ来调节角质形成细胞增殖能力(CK6表达水平)。结论：银屑病患者皮损处表皮的TNIP1蛋白水平降低,而mRNA水平升高。下调小鼠皮肤局部TNIP1蛋白水平,会加剧IMQ诱导的小鼠银屑病样皮炎表现,提示TNIP1对银屑病有保护作用。在体外TNIP1蛋白水平下调后会促进角质形成细胞的增殖,反之,则抑制增殖。推测TNIP1可能通过调节角质形成细胞增殖参与银屑病致病。我们的研究显示TNIP1有望成为银屑病治疗的生物治疗靶点之一。
【关键词】：银屑病 TNIP1-角质形成细胞 增殖 角蛋白CK6 Erk1/2 C/EBPβ 短发夹干扰RNA 小干扰RNA 慢病毒载体 咪喹莫特
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R758.63
【目录】：

• 缩略语表4-6
• Abstract6-13
• 摘要13-18
• 第一章 前言18-24
• 第二章 TNIP1特异性短发夹干扰RNA慢病毒载体(TNIP1 shRNA)和重组TNIP1(rTNIP1)慢病毒载体的构建、扩增及体内外转染24-57
• 2.1 材料与方法25-44
• 2.2 结果44-51
• 2.3 讨论51-55
• 2.4 小结55-57
• 第三章 TNIP1调节角质形成细胞增殖及机制研究57-74
• 3.1 材料与方法57-63
• 3.2 结果63-70
• 3.3 讨论70-72
• 3.4 小结72-74
• 第四章 TNIP1对咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮炎影响74-80
• 4.1 材料与方法74-76
• 4.2 结果76-77
• 4.3 讨论77-79
• 4.4 小结79-80
• 全文总结80-81
• 参考文献81-87
• 文献综述 银屑病免疫发病机制研究及生物治疗进展87-99
• 参考文献96-99
• 攻读博士学位期间已经发表的论文99-100
• 致谢100-101

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1 陈艳;TNIP1蛋白在银屑病发病中的作用及机制研究[D];第三军医大学;2015年

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本文编号：950725