小鼠黑素瘤细胞exosomes诱导小鼠成纤维细胞侵袭能力的表达
发布时间：2017-10-06 21:06
本文关键词：小鼠黑素瘤细胞exosomes诱导小鼠成纤维细胞侵袭能力的表达
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【摘要】：研究背景外泌体(exosomes)是真核细胞释放的一种由磷脂双层分子层构成的类膜囊结构,它能将分子信号水平地从一个细胞传递至另一个细胞,影响受体细胞的功能和行为。Exosomes所包含的成分和携带的信息主要决定于其源细胞的特性。肿瘤细胞来源的exosomes具备完整的mRNAs、microRNAs、蛋白质,携载肿瘤细胞信息。有研究表明,肿瘤可与周围环境“cross-talk”影响周围正常间质细胞,使间质细胞表型发生改变并释放金属蛋白酶及趋化因子,以降低细胞黏附力、破坏基底膜和促血管生成,有利于肿瘤细胞的侵袭转移。在肿瘤细胞改造正常细胞的过程中,是否存在肿瘤细胞exosomes通讯方式?本课题以小鼠黑素瘤B16-F10细胞和其同源的C57小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)为材料,研究B16-F10细胞的exosomes对MEF细胞的侵袭迁移性的影响,验证肿瘤细胞向正常细胞传递侵袭性的exosomes通讯方式,从exosomes细胞间通讯的角度,诠释肿瘤细胞侵袭转移性的现象,为寻求控制肿瘤侵袭转移的方法提供一种新的思路。目的1.确定B16-F10细胞exosomes的制备方法及其结构特征。2.分析b16-f10细胞exosomes对mef的侵袭性的影响,验证肿瘤细胞向正常细胞传递侵袭性的exosomes通讯方式。方法1.采用100000×g超速离心方法从b16-f10细胞培养上清液中分离提取exosomes,纳米颗粒跟踪分析法分析尺度分布,戊二醛固定、环氧树脂包埋、枸橼酸铅染色后透射电镜观察exosomes超微结构,western-blot分析tsg101、tyrp2的表达情况。2.从13.5天c57小鼠胚胎分离纯化小鼠胚胎成纤维细胞(mef)。将b16-f10细胞的exosomes与mef细胞共培养,实时无标记动态细胞分析技术(rtca)记录不同浓度exosomes与mef共培养72小时mef细胞侵袭力和迁移力的动态变化。收集共培养48h的mef细胞,qpcr检测细胞的mmp-2、mmp-9、e-cadherinmrna表达,western-blot检测mmp-2、mmp-9、e-cadherin蛋白表达水平。采用cfse荧光染料示踪exosomes,共聚焦荧光显微镜观察exosomes与mef细胞的融合过程。结果1.100000×g超速离心法从b16-f10细胞分离出一种具有直径约主要分布在90~430nm,平均粒径为169.7±4.62nm的脂质双分子膜构成的囊泡状结构,并表达exosomes特征蛋白tsg101、黑素瘤特征蛋白tyrp2。2.b16-f10细胞exosomes与mef细胞共培养72h,exosomes浓度0.6g/l组mef细胞侵袭力最强,exosomes浓度1.2g/l组次之,0.3g/l组与对照组无明显差异(p0.05)不具浓度依赖性。0.6g/L exosomes组12h、24h时未见明显差异(p0.05),36h时,共培养组MEF细胞指数(CI)高于对照组(p0.05),当培养至48h时,共培养组CI值明显高于对照组(p0.01)。共培养组MEF细胞MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表达高于对照组,E-cadherin蛋白及RNA表达低于对照组。MEF细胞的迁移力未见明显变化(p0.05)。CFSE-exosomes与MEF细胞共培养6h后,在MEF细胞间可CFSE-exosomes的绿色荧光,偶见具有绿色荧光的MEF细胞。共培养12h后,可见部分MEF细胞内出现绿色荧光。共培养18h后,接近一半的MEF细胞内出现绿色荧光,共培养至48h时,几乎所有的MEF细胞内均可见绿色荧光。结论1.采用100000×g超速离心的方法可制备主要分布在90~430 nm,平均粒径为169.7±4.62nm,具有脂质双分子膜并表达特征蛋白TSG101、TYRP2蛋白的exosomes。2.来自于B16-F10细胞的exosomes进入MEF细胞,诱导MEF细胞表达侵袭性表型,提示在恶性肿瘤细胞与正常细胞间可能存在肿瘤细胞向正常细胞传递侵袭性的exosomes通讯方式。
【关键词】：Exosomes 黑素瘤细胞 小鼠胚胎成纤维细胞 侵袭性
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.5
【目录】：
- 英汉缩略语名词对照5-6
- 中文摘要6-9
- 英文摘要9-13
- 前言13-15
- 参考文献14-15
- 第一部分 B16-F10细胞exosomes的制备与鉴定15-24
- 1.材料与方法15-19
- 2 结果19-21
- 3 讨论21-22
- 4 小结22-23
- 参考文献23-24
- 第二部分 B16-F10细胞exosomes对小鼠胚胎成纤维细胞侵袭迁移性的影响24-46
- 第一章 MEF细胞与B16-F10细胞exosomes的融合25-32
- 1 材料与方法25-27
- 2 结果27-30
- 3 讨论30
- 4 小结30-31
- 参考文献31-32
- 第二章 B16-F10细胞exosomes对MEF细胞侵袭迁移力的影响32-46
- 1 材料与方法32-38
- 2 结果38-43
- 3 讨论43-44
- 4 小结44-45
- 参考文献45-46
- 全文总结46-47
- 文献综述47-55
- 参考文献51-55
- 致谢55-56
- 硕士期间发表的文章56
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本文编号：984993
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