BMSCs移植治疗帕金森病细胞学机制的实验研究

发布时间：2017-10-13 06:13

  本文关键词：BMSCs移植治疗帕金森病细胞学机制的实验研究

  更多相关文章： GFP大鼠 帕金森病 骨髓间充质干细胞 移植 星形胶质细胞

【摘要】：帕金森病(Parkinsons'disease, PD)是常见于中老年人的一种中枢神经系统退行性疾病,严重影响患者的生活质量。鉴于PD发病的主要病理机制和干细胞研究的深入,细胞移植治疗有望成为治疗该病的理想方法之一,但是细胞移植治疗的机制尚未明确。本实验以转绿色荧光蛋白(GFP)基因大鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为示踪细胞,探讨外源细胞在治疗模型大鼠时,在脑内的存活、迁移及分化情况,并结合大鼠脑内星形胶质纤维蛋白(GFAP)的表达变化,探究星形胶质细胞(AST)在治疗PD的作用,为研究临床PD的细胞移植治疗机理提供实验依据。实验一转GFP基因大鼠BMSCs作为示踪细胞在移植治疗帕金森病研究中的应用采用立体定位法单侧纹状体内单点注射6-羟多巴胺(6-OHDA)制备PD大鼠模型,术后以经典的阿扑吗啡(APO)诱导大鼠的转圈数为指标进行行为学检测,筛选成功PD大鼠模型。取转GFP基因大鼠的BMSCs,将纯化的BMSCs定位移植到PD模型大鼠损毁侧纹状体内,移植后2周起用APO诱导大鼠转圈行为,检测细胞移植对PD模型大鼠的行为改善情况；在荧光显微镜下观察实验大鼠的脑组织切片,追踪外源GFP大鼠BMSCs在受体脑内的存活、迁移情况；并以免疫组化技术检测多巴胺能神经细胞的特异性蛋白——酪氨酸羟化酶(TH)的表达,研究分化规律。成功PD大鼠的转圈数为10.89±1.08 r/min,转GFP基因大鼠的BMSCs移植脑内损毁部位后,从第2周开始,旋转圈数逐渐减少,到第8周降至5.86±1.15 r/min。细胞移植后,可在纹状体内见到GFP标记的外源细胞,其至少可存活6周；移植后部分细胞向周围迁移并有一定的走向,可迁移到大鼠脑内广泛区域；移植的BMSCs形态上多数呈现分化形态,在移植后6周,荧光免疫组化检测除见到GFP细胞的TH阳性表达,在移植针道周围还见到大量的内源性神经细胞出现TH阳性表达,即BMSCs在纹状体内能定向分化为神经元样细胞,并能够使残存的多巴胺(DA)能神经元功能恢复。研究结果显示BMSCs移植技术,对改善PD模型大鼠的行为有明显效果,提示可能机制是外源BMSCs在脑内经诱导分化为多巴胺能神经元,部分替代了损毁的多巴胺能神经元的功能；移植的外源BMSCs通过产生某些营养因子,有效地恢复模型动物中DA神经元的功能或使内源性更多的神经元样细胞特异化为合成多巴胺的细胞,从而改善PD模型的症状。GFP转基因大鼠的BMSCs由于自发荧光,移植后方便观察外源细胞在受体脑内的存活、迁移和分化规律,是细胞移植研究中具有广泛运用前景的示踪细胞。实验二移植BMSCs对帕金森病模型大鼠脑内星形胶质细胞GFAP表达的影响本研究通过检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,探究脑内星形胶质细胞(AST)在BMSCs移植治疗PD中的功能。实验分别提取正常大鼠、PD模型大鼠和BMSCs移植治疗4周及8周大鼠脑的总RNA和蛋白,再以荧光定量PCR和western blot方法测定脑内GFAP的mRNA及蛋白的含量,对比分析模型及治疗前后mRNA表达水平的变化与蛋白表达水平变化的联系,同时结合酪氨酸羟化酶(TH)的蛋白表达水平及荧光免疫组化检测大鼠脑组织内TH的表达变化,从而直观地了解大鼠脑内多巴胺能神经元的变化与AST的关系。结果显示,模型大鼠损毁侧脑纹状体内GFAP mRNA的表达水平是正常大鼠的1.33倍,GFAP蛋白表达也高于正常鼠,但是TH蛋白含量明显减少；BMSCs移植治疗后,脑内GFAP mRNA的表达逐渐减少,术后4周的大鼠原损毁侧脑的表达量是对照模型鼠的0.63倍,GFAP蛋白却增加,TH蛋白表达也增加；术后8周大鼠原损毁侧脑GFAP mRNA的表达是对照模型鼠的0.30倍,GFAP蛋白亦减少,TH蛋白表达增加,最后均接近于正常大鼠脑内蛋白的表达。荧光免疫组化法,可见外源细胞周围TH含量明显增多,代替多巴胺能神经元的神经元样细胞也较模型大鼠增多。BMSCs移植治疗PD大鼠模型的过程中,正常动物脑内GFAP免疫组化表达阴性,但在制备PD模型的过程中,星形胶质细胞活化,并出现GFAP的增强表达,成为反应性星形胶质细胞,而损伤修复后GFAP的表达又呈阴性。GFAP是星形胶质细胞活化的独有标志,因此,研究星形胶质细胞在治疗帕金森大鼠模型研究中的变化对探究帕金森治疗机制有重要意义。作为支撑性细胞,能准确引导神经元迁移到脑内损伤部位,并且分泌出大量的营养因子,促进DA神经元的生成而修复黑质-纹状体DA神经通路,其中最为重要的营养因子GFAP,对脊椎动物有强烈的保护作用,并且在中枢神经系统(CNS)中行使重要功能。因此AST为外源细胞在脑内的迁移作出巨大的贡献,为研究BMSCs移植治疗PD的机理研究提供新的思路。
【关键词】：GFP大鼠 帕金森病 骨髓间充质干细胞 移植 星形胶质细胞
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 符号说明9-10
• 第一部分 文献综述10-29
• 第一章 骨髓间充质干细胞及其移植治疗帕金森病的研究进展10-17
• 1 骨髓间充质干细胞的概述10-14
• 2 帕金森病的概述14-15
• 3 骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病的机制研究15-17
• 第二章 星形胶质细胞在治疗PD中的应用与GFAP检测的研究进展17-22
• 1 星形胶质细胞作用研究17-19
• 2 GFAP的检测方法19-22
• 参考文献22-29
• 第二部分 研究论文29-60
• 第一章 转GFP基因大鼠BMSCs作为示踪细胞在移植治疗帕金森病研究中的应用29-44
• 1 材料与方法29-31
• 2 实验方法31-35
• 3 结果35-41
• 4 讨论41-44
• 第二章 移植BMSCs对帕金森病模型大鼠脑内星形胶质细胞GFAP表达的影响44-60
• 1 实验材料44-46
• 2 实验方法46-51
• 3 实验结果51-57
• 4 讨论57-60
• 全文小结60-61
• 参考文献61-63
• 致谢63-64
• 攻读学位期间发表的学术论文目录64-65

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本文编号：1023258