Foxo1介导脑出血损伤后的炎症反应及其机制研究

发布时间：2017-10-22 17:30

  本文关键词：Foxo1介导脑出血损伤后的炎症反应及其机制研究

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【摘要】：背景:叉形头转录因子O亚型(Forkhead box O1,Foxo)是一种存在于真核生物的重要转录因子,其生物学功能在临床上应用广泛。在Foxo的众多家族成员中,对于Foxo1的研究较为广泛。目前已被证明其与凋亡、炎症和细胞生长等病理生理或生理现象密切相关。近年来发现Foxo1在机体多种组织器官炎症反应中发挥重要作用,但在脑出血后炎症反应却未见报道。因此,通过调控Foxo1的表达,在脑出血后炎症损伤以及疾病恢复等方面具有深远的临床意义。目的:探讨调控Foxo1对大鼠脑出血后炎症损伤的保护作用以及对其下游炎症因子的作用。方法:运用抽取的自体术侧股动脉血注入同侧大脑纹状体建立脑出血(Intracerebral Hemorrhage,ICH)模型。在脑出血后Foxo1表达最佳时间点筛选实验中,将SD大鼠随机分为假手术(sham)组、脑出血手术1h、6h、12h、24h、48h与72(ICH1h、6h、12h、24h、48h与72h)组,筛选Foxo1在ICH后最佳表达时间点;Foxo1表达最佳脑区筛选实验中,将SD大鼠随机分为术侧纹状体(Ipsi-CS)、术侧皮质(Ipsi-CX)、对侧纹状体(Cont-CS)与对侧皮质(Cont-CX)组,筛选Foxo1在ICH后最佳表达脑区;特异性si RNA筛选实验中,将SD大鼠随机分为ICH+无序序列siRNA(nonsiRNA)和3条特异性siRNA处理(foxo1sirna-1285、foxo1sirna-1612、foxo1sirna-1434)组,处理组于ich建模前24h术侧侧脑室注射,筛选最佳sirna;在foxo1炎症损伤与下游因子影响实验中,将sd大鼠分为假手术(sham)组、筛选时间点后的手术(ich)组、ich+筛选后的sirna处理(ich+sirna)组与ich+无序序列sirna(nonsirna)组,观察foxo1的调控是否具有脑保护作用与对其下游炎症因子的影响,并探讨相关机制。具体方法如下:(1)大鼠脑出血1h、6h、12h、24h、48h与72h后,将大鼠灌注、断头、处死并取脑组织蛋白。利用westernblot蛋白印迹筛选foxo1最佳表达时间后,westernblot蛋白印迹与rt-pcr筛选foxo1最佳表达脑区。(2)筛选出foxo1表达最佳时间点与脑区后,利用westernblot蛋白印迹法检测foxo1蛋白在大鼠脑组织中的最佳时间点与脑区中表达,筛选出最高效的foxo1干扰序列。(3)对sham组、ich组、ich+foxo1sirna和ich+nonsirna组大鼠进行garcia神经功能评分与干-湿重脑水含量分析,westernblot蛋白印迹与rt-pcr检测foxo1的蛋白与mrna水平。(4)westernblot蛋白印迹测定tlr4、nf-κb、tnf-α、il-1β与il-18蛋白的表达,并采用酶联免疫吸附试验法(elisa)检测mpo、il-1β与il-18的蛋白浓度。结果:(1)foxo1在ich12h之前呈上升趋势,并在12h的表达达到最高峰,同时随时间推移又呈下降趋势。位于12h时间点的蛋白表达条带灰度值/内参灰度值均高于其它时间点,存在显著性差异(p0.01)。(2)foxo1在insi-cs中的蛋白表达条带灰度值/内参灰度值与mrna水平均高于其它三个脑区(insi-cx,cont-cs,Cont-CX),存在显著性差异(P0.01)。(3)Foxo-siRNA-1612片段干扰后Foxo1表达条带灰度值/内参灰度值最低,其干扰效率达50%以上,干扰效果最佳,存在显著性差异(P0.01)。(4)ICH+siRNA组大鼠相对于ICH组与ICH+nonsiRNA组,Foxo1表达条带灰度值/内参灰度值与mRNA水平均显著性降低,存在显著性差异(P0.01)。(5)ICH+siRNA组大鼠的Garcia评分均显著性高于ICH组与ICH+nonsiRNA组,脑水含量均显著性低于ICH组与ICH+nonsiRNA组,存在显著性差异(P0.01);并且在ICH组与ICH+nonsiRNA组术侧脑水含量显著性高于对侧脑,存在显著性差异(P0.01);而ICH+siRNA组大鼠术侧脑水含量明显高于对侧脑,存在明显差异(P0.05)。(6)ICH+siRNA组大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β与IL-18表达条带灰度值/内参灰度值均显著性低于ICH组与ICH+nonsiRNA组;MPO、IL-1β与IL-18蛋白浓度水平均显著性低于ICH组与ICH+nonsiRNA组,存在显著性差异(P0.01)。结论:(1)Foxo1在大鼠脑出血后12h的术侧纹状体中表达最明显;si RNA能特异性抑制体内Foxo1基因的表达,减少神经功能缺损与水肿。(2)siRNA干扰Foxo1后,Foxo1下游的炎症因子蛋白水平与浓度均可得到有效的抑制,并阐明Foxo1的可能通过TLR4/NF-κB信号通路实现进行炎症反应,而抑制Foxo1的表达可能是其实现脑出血后抗炎反应作用的重要机制之一。
【关键词】：Foxo1 脑出血 炎症反应 TLR4
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.34
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-14
• 第一部分 Foxo1在不同时间点与出血后大鼠脑区的表达情况探究14-25
• 1 实验材料14-16
• 2 实验方法16-22
• 3 实验结果22-24
• 4 讨论24-25
• 第二部分 SiRNA干扰Foxo1后对脑出血损伤的影响以及对经由Foxo1的下游炎症因子的调控作用25-38
• 1 实验材料25-26
• 2 实验方法26-30
• 3 实验结果30-36
• 4 讨论36-38
• 参考文献38-41
• 文献综述41-50
• 参考文献47-50
• 致谢50-51
• 攻读硕士期间发表的论文51

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本文编号：1079382