GM1联合生长因子诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

发布时间：2017-10-25 22:14

  本文关键词：GM1联合生长因子诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

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【摘要】：目的骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一群能不断自我更新、分裂增殖,且具多谱系分化潜能的多能干细胞。碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)和表皮生长因子(EGF)能有效促进BMSCs向神经元样细胞分化,且对细胞几乎无毒副作用。单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)是神经细胞质膜的重要组成成分,对神经细胞分化和成熟过程必不可少,并可保护和修复受损神经细胞。本研究旨在探讨GM1联合生长因子(b FGF+EGF)能否更为高效地促进BMSCs分化为神经元样细胞,从而为细胞替代治疗神经系统变性疾病提供实验依据。方法采用密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞,行原代、传代培养,观察细胞形态变化和生长情况;取第3代BMSCs,用流式细胞术鉴定其表面标志物(CD29、CD105、CD34、CD45);同时鉴定其多分化潜能。将第3代BMSCs分四组向神经元样细胞诱导分化,A组:单用生长因子(b FGF+EGF);B组:单用GM1;C组:GM1联合生长因子(b FGF+EGF);D组:对照组。分别在正式诱导前、后行免疫细胞化学法检测各组细胞Nestin、β-TubulinⅢ、GFAP的阳性表达率并用SPSS18.0进行数据统计分析。结果骨髓单个核细胞接种于培养瓶24h后可见多数细胞已贴壁,48h首次全量换液,可见较多骨髓单个核细胞散在分布。原代培养5-6天可见散在分布的短梭形、多角形或宽大扁平形细胞而形成的集落;8-11天,细胞生长速度明显加快,形态逐渐变成梭形;14-16天,细胞逐渐铺满培养瓶底,可达80%-90%融合,呈漩涡状分布;传代后的细胞,形态与原代相似,但其生长潜伏期明显缩短。流式细胞术鉴定第3代BMSCs表面标志物呈CD29(+)、CD105(+)、CD34(-)、CD45(-);同时其具分化为成骨细胞和成脂细胞潜能。BMSCs诱导分化为神经元样细胞之前,四组细胞Nestin、β-Tubulin、GFAP表达均呈阴性;正式诱导2-4天,A、B、C三组Nestin阳性细胞表达率均呈上升趋势,且C组高于A、B、D组;正式诱导6-8天,A、B、C三组Nestin阳性细胞表达率均有所降低,而β-TubulinⅢ、GFAP阳性细胞表达率则呈较明显上升趋势,且C组较A、B组升高明显。综合实验数据,C组的Nestin、β-TubulinⅢ、GFAP阳性细胞表达率均高于A、B、D组。结论1.采用密度梯度离心法结合细胞贴壁培养法来分离、培养BMSCs,可获得较高纯度的BMSCs,且细胞活性较高,适用于进一步实验研究。2.GM1联合生长因子(b FGF+EGF)相比单独的生长因子(b FGF+EGF)或GM1,可更为高效地促进BMSCs诱导分化为神经元样细胞。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 GM1 生长因子 诱导 神经元样细胞
【学位授予单位】：宁波大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 摘要4-6
• 英文摘要6-10
• 引言10-13
• 1 BMSCs的分离、原代及传代培养、冻存和鉴定13-23
• 1.1 实验材料13-14
• 1.1.1 主要实验试剂13-14
• 1.1.2 主要实验仪器14
• 1.2 实验方法14-17
• 1.2.1 BMSCs的分离、原代及传代培养14-15
• 1.2.2 细胞计数15
• 1.2.3 细胞活性检测15
• 1.2.4 细胞冻存和复苏15-16
• 1.2.5 流式细胞术鉴定BMSCs的纯度16
• 1.2.6 BMSCs向成骨细胞和成脂细胞诱导分化的鉴定16-17
• 1.3 实验结果17-20
• 1.3.1 BMSCs的分离、原代及传代培养结果17-18
• 1.3.2 细胞活性检测结果18-19
• 1.3.3 BMSCs表面标志物鉴定结果19
• 1.3.4 BMSCs向成骨细胞和成脂细胞诱导分化的鉴定结果19-20
• 1.4 讨论20-23
• 2 BMSCs诱导分化为神经元样细胞23-32
• 2.1 实验材料23-24
• 2.1.1 主要实验试剂23
• 2.1.2 主要实验仪器23-24
• 2.2 实验方法24-25
• 2.2.1 玻片预处理24
• 2.2.2 BMSCs定向诱导分化为神经元样细胞24
• 2.2.3 免疫细胞化学法鉴定神经元样细胞24-25
• 2.2.4 统计学分析25
• 2.3 结果25-29
• 2.3.1 免疫细胞化学法鉴定神经元样细胞结果及数据分析25-29
• 2.4 讨论29-32
• 3 结论32
• 参考文献32-35
• 附录A 缩略词表(Abbreviation)35-36
• 附录B 文献综述36-43
• 参考文献40-43
• 在学研究成果43-44
• 致谢44

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本文编号：1095728