CRMP2对大鼠缺血再灌注脑损伤后细胞凋亡及神经再生的影响研究

发布时间：2017-10-27 11:30

  本文关键词：CRMP2对大鼠缺血再灌注脑损伤后细胞凋亡及神经再生的影响研究

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【摘要】：背景及目的急性缺血性脑卒中患者超早期静脉溶栓或动脉血管机械开通术可以恢复脑血流,避免脑梗死形成,保留神经功能。但早期脑缺血再灌注后将引起一系列级联反应损伤脑细胞,其机制涉及脑组织能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载、氧化应激损伤、炎症反应等诸多环节。最后,由于激活细胞凋亡基因导致细胞程序性死亡,使缺血半暗带区与梗死区融合。因此,血管再通也会造成神经细胞的损伤,脑梗死的治疗仍然需要神经保护剂的参与。神经保护指在急性缺血性脑卒中的治疗中,阻止缺血引起的脑组织一系列的病理生理反应,干扰缺血瀑布反应的各个环节,延长神经元存活的药物或措施。脑衰反应调节蛋白2(Collapsin response mediator protein 2,CRMP2)是胞质磷酸化蛋白CRMP1-5家族的成员之一,该家族参与了神经元分化及轴突导向,并在发育期脑组织中丰富表达。CRMP2已被证实在诸多神经系统疾病中具有神经保护作用,如阿尔兹海默病、精神分裂症以及脑血管病等。本课题组前期实验证实,CRMP2有利于大鼠缺血再灌注后神经轴突的修复。国内外大量研究证实CRMP2在神经修复、促轴突再生方面的强大作用也显示了其良好的神经保护潜能。然而,其在脑缺血再灌注损伤后的具体保护作用及机制尚不明确。本研究拟通过外源性上调CRMP2在脑组织中的表达,探讨其对缺血再灌注后神经细胞凋亡及神经再生的影响及可能机制。方法第一部分1.健康成年雄性SD大鼠18只,体重250-300g,由重庆医科大学实验动物中心提供,随机分为正常组(Normal),对照组(Control)即单纯缺血再灌注组,侧脑室加空质粒组(LV+VP),海马加空质粒组(H+VP),皮质加空质粒组(C+VP),嗅球加空质粒组(OB+VP),每组n=3,Western blot检测各组CRMP2的表达。2.成年雄性SD大鼠100只,随机分为空白质粒组(VP)、侧脑室组(LV)、海马组(H)、皮质组(C)及嗅球组(OB),每组n=20,24h和48h各10只(5只用于GFP检测,5只用于Western blot及q-PCR检测)。第二部分1.雄性SD大鼠100只,侧脑室注射1天,制作MCAO/再灌注模型,随机分为sham组,MCAO组,MCAO+GFP组,MCAO+CRMP2/GFP组。缺血再灌注48h、1w,Western blot检测脑缺血损伤后CRMP2、AIF及NMDAR2B的表达。TUNEL法检测脑缺血损伤后凋亡细胞。2.荧光定量PCR检测各组脑缺血损伤后48h、1w各组大鼠缺血灶周围脑组织CRMP2、Bcl2、Caspase3、Caspase8及P53的表达。3.脑缺血再灌注损伤后48h,TTC检测各组大鼠脑梗死体积;48h、1w,对各组大鼠进行神经功能缺损评分,比较过表达CRMP2干预对脑缺血损伤后大鼠神经功能恢复的影响。第三部分1.雄性SD大鼠120只,侧脑室注射质粒1天后,制作MCAO/再灌注模型,随机分为sham组,MCAO组,MCAO+GFP组,MCAO+CRMP2/GFP组。缺血再灌注7天免疫荧光检测缺血侧皮质GFAP及MAP2的表达。再灌注后5-7天腹腔注射Edu,荧光检测SVZ区及皮质Edu标记的阳性细胞数;免疫荧光检测Nestin/Edu及DCX/Edu标记阳性细胞数。再灌注后14天免疫荧光检测GFAP/Edu及MAP2/Edu标记的阳性表达量。2.Western blot检测7天、14天BDNF的表达;免疫组化检测7天、14天缺血侧BDNF及NGF的表达。大鼠灌注取脑前进行神经功能评分。结果第一部分海马和侧脑室注射CRMP2真核表达质粒后24h及48h激光共聚焦结果显示:24h侧脑室和海马的GFP的表达量均较48h多;不同部位注射CRMP2真核表达质粒后,皮质CRMP2的表达均有增高,其中侧脑室组及海马组的转染效率明显高于皮质组及嗅球组(p0.01),而侧脑室组比海马组稍高,但统计学差异不明显(p0.05)第二部分1.脑缺血损伤后48 h及1 w CRMP2蛋白表达降低,CRMP2真核质粒干预后,CRMP2的蛋白表达明显升高(p0.01)。脑缺血再灌注损伤后,缺血灶周围脑组织TUNEL阳性细胞表达量增多,CRMP2真核表达质粒干预使TUNEL阳性细胞减少(p0.01)。2.脑缺血再灌注48 h及1 w,与sham组比较,缺血再灌注后BCL2的m RNA的表达水平明显降低(p0.01),而同时Caspase-3、Caspase-8以及P53的m RNA表达升高(p0.01);与MCAO及MCAO+GFP组比,真核质粒干预脑缺血组织后升高了BCL2的m RNA水平(p0.01),同时明显降低了P53、Caspase-3、Caspase-8的m RNA水平(p0.01)。与假手术相比,脑缺血再灌注损伤还使细胞核AIF蛋白表达量增加,而过表达CRMP2使细胞核AIF表达量降低(p0.01)。3.与sham组相比,48h及1w脑缺血再灌注损伤使NMDAR2B表达量升高,而过表达CRMP2降低了其表达(p0.01)。4.再灌注后48 h,MCAO组及MCAO+GFP组大鼠缺血侧可见明显的梗死灶,并伴有严重的神经功能缺损(p0.01);真核质粒干预后梗死灶明显缩小(p0.01),神经功能缺损明显减轻(p0.01)。1 w后,缺血各组大鼠的神经功能均有所恢复,但MCAO+CRMP2/GFP组的神经功能评分明显高于其他两组(p0.01)。第三部分1.与sham组相比,再灌注后7天,MCAO组大鼠可见明显的神经元的丢失及大量胶质细胞的激活。MCAO+GFP组大鼠皮质MAP2及GFAP的表达与MCAO组无明显差异(p0.05)。而CRMP2真核质粒干预后,MAP2表达增多(p0.01),GFAP的表达明显减少(p0.01)。2.与假手术比,脑缺血再灌注损伤,促进了SVZ区及缺血皮质区Edu标记阳性细胞的表达(p0.05);而CRMP2真核质粒干预之后Edu在两个部位的表达量较其余三组均增多(p0.05),提示过表达的CRMP2可促进神经细胞增殖。免疫荧光双标显示,缺血再灌注后7d,MCAO组及MCAO+GFP组Nestin与Edu及DCX/Edu的双标阳性细胞数量较假手术组明显增多(p0.05),而两组之间无明显差异(p0.05)。过表达CRMP2之后Nestin与Edu及DCX/Edu的双标数量较其余三个组明显增多(p0.05),提示CRMP2促进了内源性神经干细胞的增殖。3.缺血再灌注后14d,MCAO组及MCAO+GFP组可见明显的MAP2与Edu双标表达,CRMP2真核表达质粒干预组MAP2与Edu双标的表达量较MCAO组及MCAO+GFP组明显增多(p0.05);缺血再灌注后14d,CRMP2真核表达质粒干预组GFAP与Edu双标的表达量较MCAO组及MCAO+GFP组无明显差异(p0.05)。4.缺血再灌注后7d与14d可见BDNF及NGF的表达量明显增多,而过表达CRMP2使BDNF及NGF的表达量均进一步升高(p0.05)。同时,与MCAO组及MCAO+GFP组相比,过表CRMP2使大鼠神经功能缺损明显减轻(p0.05)。结论1.CRMP2真核表达质粒能够成功转染大鼠脑组织,使缺血区皮质CRMP2蛋白及m RNA的表达明显增高。侧脑室的转染效率较其他三个部位更高。2.CRMP2对Caspase依赖的线粒体凋亡通路以及AIF异位均有调控作用,从而减少了脑缺血再灌注损伤后的神经细胞凋亡及脑梗死体积,起到了神经保护作用。而其对凋亡通路的调控,可能是通过影响NMDAR2B受体实现的。3.CRMP2减少了大鼠脑缺血再灌注损伤后神经元的丢失;通过影响BDNF及NGF的表达,促进了大鼠脑缺血再灌注损伤后内源性神经干细胞的增殖、分化为成熟的神经元。
【关键词】：CRMP2 脑缺血/再灌注 凋亡 神经再生
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-5
• 中文摘要5-11
• 英文摘要11-17
• 前言17-20
• 第一部分 CRMP2真核表达质粒在缺血/再灌注大鼠脑皮质转染效率的对比研究20-37
• 前言20
• 1 材料与方法20-29
• 2 结果29-31
• 3 讨论31-33
• 参考文献33-37
• 第二部分 CRMP2对缺血再灌注脑损伤后神经细胞凋亡的影响及可能机制研究37-54
• 前言37
• 1 材料与方法37-41
• 2 结果41-48
• 3 讨论48-51
• 参考文献51-54
• 第三部分 CRMP2对缺血再灌注脑损伤后神经再生影响及机制54-70
• 前言54
• 1 材料与方法54-59
• 2 结果59-65
• 3 讨论65-67
• 参考文献67-70
• 附图70-78
• 文献综述：CRMP2与脑卒中后的神经保护78-87
• 参考文献83-87
• 致谢87-88
• 攻读硕士期间发表文章88

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本文编号：1103311