内源性促生存蛋白Iduna在新生鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用

发布时间：2017-10-27 13:22

  本文关键词：内源性促生存蛋白Iduna在新生鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用

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【摘要】：围产期窒息所致缺氧缺血性(hypoxic-ischemic,HI)脑损伤,是导致新生儿死亡和慢性残障的主要原因。全球每年用于HI脑病治疗和护理的费用给社会、家庭和个人带来沉重负担。由于新生儿大脑的不同部位对HI损伤呈选择性,针对特定易损神经系统和细胞群的治疗机会非常有限。探索HI脑损伤确切机制并寻找有效治疗方案,是目前医学领域的重要课题之一。研究表明,谷氨酸作用与N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体介导的神经兴奋毒性和氧化应激在HI脑损伤中扮演重要角色,我们前期在HI脑损伤动物模型中也证实了这一点。在成年脑缺血模型中,兴奋毒性和氧化损伤,可直接或间接激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1),催化合成大量死亡分子聚腺苷二磷酸核糖(Poly ADP-ribose,PAR)聚合物,诱导线粒体凋亡诱导因子(Apoptosis Inducing Factor,AIF)进入细胞核,导致PARP1依赖性细胞死亡(Parthanatos)的发生。新近发现的NMDA受体诱导产生的存活蛋白Iduna,是一种内源性PAR/AIF死亡通路抑制剂,可通过特异性结合PAR,干扰AIF核转位,从而抑制谷氨酸及其NMDA受体兴奋毒性介导的细胞死亡。上调Iduna的表达水平,能够抑制PAR信号介导的Parthanatos,从而对NMDA受体兴奋毒性引起的脑损伤产生保护作用。那么Iduna蛋白在新生鼠中的表达与定位是怎样的情况?新生鼠HI脑损伤过程中是否同样存在由PAR介导的神经元细胞Parthanatos死亡呢?而Iduna表达与AIF的关系如何?在原代神经元细胞中上调Iduna后,是否会降低氧糖剥夺(OGD)对细胞造成的损伤呢?本研究主要有三个部分,实验一拟研究以新生大鼠为对象,观察Iduna在脑组织中的表达及细胞定位。实验二拟研究新生大鼠HI脑损伤过程中,大脑皮层损伤与Iduna的关系,以及Iduna表达与AIF的关系。实验三拟构建大鼠Iduna c DNA的慢病毒表达质粒,观察原代神经元细胞中Iduna上调后细胞损伤情况。第一部分内源性促生存蛋白Iduna在新生大鼠脑组织中的表达及细胞定位目的明确内源性存活蛋白Iduna在新生大鼠脑组织中的表达水平及其细胞定位。方法取SD新生鼠各器官组织,采用Western-blot评价Iduna蛋白表达的组织特异性。制作SD新生鼠脑组织石蜡与冰冻切片,通过免疫组织化学观察Iduna蛋白在新生鼠脑组织的表达水平及定位特点,免疫荧光三标脑组织冰冻切片确认Iduna在神经元及星形胶质细胞中的定位。培养原代神经元及星形胶质细胞,Real-time PCR定量分析Iduna在两种神经细胞中的表达水平。在原代神经元及星型胶质细胞中通过免疫荧光双染Neu N和GFAP验证Iduna的细胞定位。结果Western-blot结果提示新生鼠肺组织中Iduna表达水平最高,其次为脑和脊髓组织;脑组织免疫组化染色显示Iduna主要表达在皮层和海马区域;大脑海马免疫荧光三标提示Iduna主要表达于神经元细胞的胞浆内(79.85%),原代神经细胞的免疫荧光三染也验证了这一结果(80.6%);RT-PCR证实Iduna在神经元中的表达丰度远远高于星形胶质细胞(P0.001)。结论1、内源性存活蛋白Iduna在新生大鼠各器官中的表达具有组织特异性,脑组织是Iduna高表达的脏器。2、脑组织中Iduna主要分布在海马及皮层区域。3、海马区和皮层区域Iduna均主要定位于神经元胞浆中,提示其可能与神经元的功能有关。第二部分新生鼠缺氧缺血性脑损伤中Iduna和AIF表达的相关性目的观察7日龄大鼠缺氧缺血性脑损失后脑皮层中Iduna与AIF表达的变化及相关性。方法96只新生大鼠被分为假手术组,缺氧1h和缺氧2h三组。在缺氧缺血性脑损伤24h后,通过HE染色、尼氏染色、透射电镜、TUNEL染色和免疫荧光法来评估HI对新生鼠大脑皮层神经元存活数量的影响。免疫组化分析HI对皮层组织Iduna表达与DNA损伤的影响。用免疫组织化学和蛋白印迹分析来检测HI对新生大鼠皮层Iduna表达水平与核内AIF含量的影响。并在HI脑损伤1个月时通过Morris水迷宫评估大鼠远期的学习和记忆能力。结果与假手术组比较,HI脑损伤后大脑皮层结构紊乱、神经元存活数量减少、细胞亚细胞器(线粒体)结构破坏以及细胞DNA断裂加剧。且缺氧2h比缺氧1h大鼠的脑损伤更加严重。另外,当Iduna表达明显减少时细胞核内的AIF表达增加。缺氧2h后Iduna表达下降并与核内AIF表达呈负相关,有统计学意义(r=-0.950,P0.0001)。缺氧后的大鼠远期学习和记忆能力均下降。结论1、新生鼠缺氧缺血性脑损伤进程中,大脑皮层组织损伤严重、神经存活数量减少、神经细胞DNA损伤严重。2、伴随缺氧缺血时长的增加,皮层组织中内源性存活蛋白Iduna含量显著下降,同时胞核内AIF的含量显著增多。3、出生早期的缺氧缺血损伤能够显著影响大鼠远期的学习记忆能力。第三部分细胞水平观察上调Iduna对缺氧神经元损伤的影响目的构建大鼠Iduna c DNA的慢病毒表达质粒(PCDH-Iduna),包装Iduna过表达慢病毒,以期上调原代神经元细胞中Iduna的表达。观察Iduna上调后对神经元细胞氧糖剥夺后细胞活性的影响。方法提取SD大鼠脑组织总RNA,利用RT-PCR的方法获取大鼠Iduna c DNA序列,将其插入慢病毒过表达载体PCDH质粒中,经酶切和测序验证重组质粒PCDH-Iduna。将PCDH-Iduna(以PCDH-EGFP为阴性对照)及包装质粒共转染HEK293T细胞,包装Iduna过表达慢病毒,显微镜下观察HEK293T细胞的形态变化,了解病毒包装情况。用慢病毒感染原代神经元细胞,Western blot检测靶细胞中Iduna的表达效率。待Iduna上调后,进行氧糖剥夺实验并采用MTT法、LDH和彗星实验检测细胞活性。结果琼脂糖凝胶电泳显示Iduna的PCR扩增产物大小为1068 bp左右片段,酶切鉴定可见有约1000bp左右片段释放,且测序结果提示克隆正确。将Iduna过表达慢病毒表达载体PCDH-Iduna及包装质粒共同转染HEK293T细胞后,镜下可见细胞呈现出毒时特有的致细胞病变效应。Iduna过表达慢病毒及其对照病毒感染原代神经元细胞,免疫荧光及Western-blot检测提示病毒感染的神经元细胞中Iduna表达增加。MTT检测显示,氧糖剥夺可导致神经元细胞存活率显著下降(P0.01),而Iduna过表达后可显著抵抗氧糖剥夺引起的神经元细胞存活率下降(P0.5)。LDH漏出率检测,氧糖剥夺可使神经元乳酸脱氢酶漏出率增加(P0.001),而Iduna过表达后可减少氧糖剥夺引起的乳酸脱氢酶漏出(P0.5)。彗星实验得出上调Iduna可以减少OGD对神经元DNA完整性的损伤。结论1、成功构建了慢病毒过表达重组质粒PCDH-Iduna。2、包装获得了具有良好感染效率的Iduna过表达慢病毒,显著上调了原代神经元细胞中Iduna的表达水平。3、上调Iduna的表达可显著抑制OGD引起的神经元损伤(如改善细胞状态、抵抗神经元死亡、保护细胞完整性以及减少DNA断裂)。
【关键词】：Iduna蛋白 蛋白表达 定位 新生鼠 神经元 胶质细胞 Iduna AIF 缺氧缺血性脑损伤 新生大鼠 Iduna 重组质粒 慢病毒 感染 氧糖剥夺
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742
【目录】：

• 摘要4-8
• abstract8-11
• 符号说明11-13
• 第一部分 内源性促生存蛋白Iduna在新生大鼠脑组织中的表达及细胞定位13-27
• 前言13
• 材料方法13-21
• 结果21-24
• 讨论24-26
• 结论26-27
• 第二部分 新生鼠缺氧缺血性脑损伤中Iduna和AIF表达的相关性27-41
• 前言27-28
• 材料与方法28-33
• 结果33-38
• 讨论38-40
• 结论40-41
• 第三部分 细胞水平观察上调Iduna对缺氧神经元损伤的影响41-57
• 前言41
• 材料与方法41-49
• 结果49-54
• 讨论54-56
• 结论56-57
• 参考文献57-60
• 综述60-74
• 参考文献68-74
• 致谢74-75
• 攻读学位期间发表的学术论文75-76
• 个人简历76

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本文编号：1103670