ATP13A2参与突触核蛋白synuclein病理学作用机理研究

发布时间：2017-10-31 08:42

  本文关键词：ATP13A2参与突触核蛋白synuclein病理学作用机理研究

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【摘要】：Parkinson's Disease(PD)是一种多系统功能障碍为主要表现的神经系统变性疾病,病理学特征是黑质多巴胺能神经元损失和路易体(Lewy body)形成。氧化应激、蛋白质误折叠和聚集的增多都涉及在PD的病理学变化中,而多巴胺能神经元退化的精确描述仍存在空缺。越来越多的遗传和生化研究揭示自噬溶酶体途径的功能障碍在帕金森病(PD)发病机制中有重要作用。目前,大多数研究集中在突触核蛋白次级聚集引起的神经毒性累积。在依赖于年龄的PD病人中,出现了溶酶体功能的损伤。这表明自噬溶酶体系统的缺陷似乎也可通过多种机制引起自噬神经毒性。ATP13A2在哺乳动物中脑有很高的表达量,其突变可导致被称作Kufor-Rakeb syndrome(KRS)的神经退行性疾病。ATP13A2部分定位于溶酶体膜,推测其功能为阳离子转运体。ATP13A2突变后对自噬溶酶体途径是否有影响,突变的ATP13A2是否参与突触核蛋白病理学,促进神经元的退化还尚未可知。为了探究这些问题,我们构建了 ATP13A2野生及突变的稳转B103神经母细胞瘤细胞株,研究ATP13A2突变基因对神经元的损伤作用,以及对自噬溶酶体途径的影响。同时在β-syn稳转B103细胞株中,过表达ATP13A2野生及突变质粒,研究在ATP13A2作用下,突触核蛋白病理学的变化。通过免疫荧光及免疫印迹技术,我们在ATP13A2稳转B103细胞株中发现:野生型ATP13A2呈聚集状态并主要定位于溶酶体,过表达ATP13A2野生型蛋白后,轻微的降低溶酶体的活性。而突变型ATP13A2蛋白在B103细胞中出现部分弥散的现象,在溶酶体的定位程度增高,显著降低了溶酶体活力。而突变型ATP13A2蛋白在内质网积留,引起内质网应激,并引起线粒体连续性降低,减弱了线粒体融合能力。ATP13A2突变蛋白引起自噬,主要通过自噬溶酶体系统降解。在β-syn稳转B103细胞株中,过表达突变型ATP13A2蛋白后,抑制了突触核蛋白降解,促进突触核蛋白聚集。LDH和WST-1显示,ATP13A2突变蛋白有明显的神经毒性作用。总的来说,ATP13A2在维持细胞内溶酶体活性方面有着重要作用,突变型ATP13A2引起内质网应激,线粒体连续性降低,增加了神经毒性。同时突变ATP13A2降低突触核蛋白降解,促进突触核蛋白聚集形成包涵体,加剧了突触核蛋白引起的神经退化。
【关键词】：ATP13A2 溶酶体 自噬 突触核蛋白
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R741
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 1. 引言10-14
• 1.1 帕金森病10
• 1.2 ATP13A2(PARK9)10-11
• 1.2.1 ATP13A2的功能与分布10-11
• 1.2.2 ATP13A2突变与帕金森症11
• 1.3 突触核蛋白病理学11-12
• 1.3.1 β-synuclein与α-synclein12
• 1.3.2 β-syn与PD12
• 1.4 自噬12-14
• 1.4.1 自噬与自噬信号通路12-13
• 1.4.2 帕金森病与自噬13
• 1.4.3 ATP13A2与自噬13-14
• 2. 材料和方法14-25
• 2.1 ATP13A2野生及稳转质粒的提取及鉴定14-17
• 2.1.1 主要仪器与设备14
• 2.1.2 试剂及配制方法14-15
• 2.1.3 实验步骤15-17
• 2.2 ATP13A2及β-syn质粒的表达与稳转细胞系的建立17-21
• 2.2.1 主要仪器与设备17
• 2.2.2 常用试剂及配制17-19
• 2.2.3 B103细胞抗药性能力评估:19
• 2.2.4 转染、药杀19-20
• 2.2.5 单克隆挑取20
• 2.2.6 免疫印迹样品蛋白裂解20
• 2.2.7 免疫印迹20-21
• 2.3 免疫荧光双标及细胞增殖、凋亡检测、酶活力检测、线粒体提取21-25
• 2.3.1 主要仪器与设备21-22
• 2.3.2 主要试剂及配制方法22
• 2.3.3 LDH细胞毒性检测22-23
• 2.3.4 WST-1细胞存活率检测23
• 2.3.5 免疫细胞化学23-24
• 2.3.6 组织蛋白酶D及26-S蛋白酶体活性测定24
• 2.3.7 线粒体提取24
• 2.3.8 数据分析统计软件及方法24-25
• 3. 结果与讨论25-46
• 3.1 ATP13A2真核表达质粒的提取鉴定25-28
• 3.2 ATP13A2在B103细胞中的分布28-29
• 3.3 ATP13A2在各细胞器中的分布以及对各细胞器的影响29-40
• 3.4 ATP13A2与突触核蛋白病理学40-46
• 4. 结论与展望46-51
• 参考文献51-61
• 致谢61-62
• 攻读学位期间发表的学术论文目录62

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本文编号：1121634