CaBP4基因突变在常染色体显性遗传夜发性额叶癫痫中的电生理功能研究

发布时间：2017-11-06 00:24

  本文关键词：CaBP4基因突变在常染色体显性遗传夜发性额叶癫痫中的电生理功能研究

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【摘要】：癫痫是最常见的慢性脑部疾病之一,是由多种因素引起大脑神经元异常同步放电,导致反复的发作性和短暂性的中枢神经系统功能异常。世界卫生组织(World Health Organization, WHO)估计全世界癫痫患者总数约为7000万人。据不完全统计,目前我国癫痫患者人数约900万,癫痫患病率可高达4‰-7‰,其中2/3为儿童癫痫患者。反复癫痫发作可加重中枢神经系统的损伤,影响患者的认知、智力、发育及生活质量等方面,甚至可致残或危及生命。目前癫痫的发病机制仍不清楚。近年来研究表明,遗传因素是癫痫的主要病因之一,其在特发性癫痫的发生中尤为显著。研究已发现高达一千多种的基因突变能够引起癫痫发作,其中约有150种癫痫表现为单基因遗传性疾病。这些孟德尔遗传方式的癫痫主要是离子通道病,大多数为编码电压门控性离子通道和配体门控性离子通道的基因突变所引起的,且基因型与临床表型表现为同质性。常染色体显性遗传夜间发作性额叶癫痫(autosomal dominant nocturnal frontal epilepsy,ADNFLE)是第一个明确致病基因的单基因遗传局灶性癫痫综合征,是以丛集性、频繁的、短暂的(数秒～数分钟)夜间运动性发作为特征,发作可表现为肌张力障碍(或)强直以及过度运动。大量的研究发现,约有12%的ADNFLE家系存在编码神经元烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)亚基的基因突变。迄今为止,已发现了nAChRs的三个位点与ADNFLE相关,分别为ENFL1、ENFL3和ENFL4。ENFL1位于染色体20q13,该区域中CHRNA4基因编码产物是乙酰胆碱受体α 4亚基。目前CHRNA4基因有5个基因突变被证实可引起ADNFLE,其中4个为错义突变(S248F, S252L, T265I和R308H),1个为插入突变(259InsL)。并且,CHRNA4基因突变在不同家系中表现出遗传异质性,这与其常染体显性遗传方式相符。ENFL3位于染色体1q21,该区域内包含了编码AChRs的β 2亚基基因(CHRNB2基因),目前己发现了6个CHRNB2基因突变,均为错义突变,分别为V287L、V287M、 L301V、V308A、I312M和V337G。ENFL4位于染色体8p21,2006年有学者发现了该区域内编码nAChRs的α 2亚基基因CHRNA2—个新杂合错义突变1279N。然而,CHRNA4、CHRNA2和CHRNB2基因突变仅覆盖小部分的ADNFLE家系,提示可能存在其他ADNFLE致病基因。研究学者相继还发现了ADNFLE其他可能的致病基因,分别为促肾上腺皮质素释放激素(CRH)基因、编码钠门控钾离子通道KCNT1基因以及DEPDC5基因。ADNFLE基因突变相关的功能研究发现,ADNFLE基因突变可导致受体功能的增强和减弱钙离子诱导的乙酰胆碱受体应答。细胞外的钙离子对神经元nAChR有双重作用。当胞外钙离子浓度在1～8微摩尔范围,胞外钙离子可增强乙酰胆碱反应；当胞外钙离子浓度在10～20微摩尔范围,它可阻滞α 4 β 2亚基与乙酰胆碱反应。突触前烟碱型乙酰胆碱受体能够同时促进兴奋性神经递质和抑制性神经递质的释放,具有负反馈调节作用的钙调控作用可阻止中枢神经元系统兴奋性神经元的突触前膜在反复同步放电的过程中过度释放兴奋性神经递质谷氨酸。但ADNFLE基因突变可使钙离子调控作用的负反馈机制失调,促进兴奋性神经元递质和减少抑制性神经递质的释放,使神经元的兴奋性升高,导致ADNFLE发生。还有研究发现,部分ADNFLE基因突变位于阻滞介导肌肉烟碱型乙酰胆碱受体的开放通道的位置上,钙离子可通过结合通道孔或其邻近位置而阻滞α 4β 2亚基nAChR应答。以上实验结果提示,钙离子在ADNFLE致病机制中起着重要作用。在前期工作中,我们应用全基因组外显子测序技术及Sanger直接测序法在一个ADNFLE家系中发现了一个CaBP4基因新错义突变即CaBP4基因p.G155D突变,本家系和其他家系内及200名对照健康人群验证均未发现此基因突变。CaBP4基因定位于染色体1lql3.2,全长828bp,含有6个外显子编码区,编码产物为含有275个氨基酸的钙连接蛋白4。钙连接蛋白4(Ca2+-bingding protein 4,CaBP4)是一种特性类似于钙调节蛋白的神经元钙连接蛋白,可参与细胞L型电压门控性钙通道的调节和神经递质的释放。目前研究发现,CaBP4基因突变可延缓钙通道的失活导致钙离子内流增多,或减弱钙离子的亲和力或结合能力致钙离子外流减少,也可影响自身蛋白结构的稳定性、与其他蛋白的相互作用的信号通路或神经递质的释放。但CaBP4基因突变尚未在癫痫有所报道。结合生物信息学分析结果,我们推CaBP4基因p.G155D突变可能引起ADNFLE发病,其作用机制可能是CaBP4新错义突变(p.G155D)改变了CaBP4蛋白的正常结构,突变后的CaBP4蛋白对钙通道的调节异常,引起神经元胞内外的钙离子自我稳态失衡,使神经元产生异常同步化放电而致癫痫发生。本研究拟应用膜片钳技术检测CaBP4基因p. G155D突变对海马锥体细胞膜电位的改变情况,明确CaBP4基因p.G155D突变在ADNFLE发病机制的电生理功能。[方法](1)构建突变型CaBP4基因重组质粒(pEGFP-N1-CaBP4mu)和野生型CaBP4基因重组质粒(pEGFP-N1-CaBP4wt),取其甘油菌进行质粒扩增及提取,应用质粒酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳实验初步鉴定构建的突变型及野生型CaBP4基因重组质粒是否成功,并进一步行基因测序进行验证；(2)取生后0～24小时的SD大鼠的大脑海马,采用胰酶及吹打联合消化方法将其消化成单个散在细胞,进行细胞计数并按照700000/孔密度种植,应用无血清培养基进行原代海马神经元培养,培养至第6～7天后采用免疫荧光方法检测原代海马神经元的纯度,并进行统计分析；(3)采用X-tremeGENE将构建的pEGFP-N1-CaBP4mu质粒和pEGFP-N1-CaBP4wt质粒分别转染至原代海马神经元,可分为实验组(转染突变型CaBP4基因重组质粒的海马神经元)和对照组(转染野生型CaBP4基因重组质粒的海马神经元),转染后72小时后应用倒置荧光显微镜观察转染后绿色荧光表达的情况及计算转染效率；(4)应用膜片钳全细胞记录技术分别记录实验组和对照组有绿色荧光表达的转染后海马神经元的L型钙通道电流以及动作电位发放频率情况。[结果](1)原代培养的海马神经元在培养第1天大多数细胞贴壁良好并伸出突起,胞体增大,呈椭圆形或锥体形；培养至第3天时,海马神经细胞以多个突起的锥体细胞为主,周边有光晕,神经元突起明显增多并伸长,相邻细胞间形成稀疏的网络：培养至第5天时,胞体进一步增大,突起明显增长,神经元之间形成稠密的网络；培养至第7天,神经元细胞已生长的比较成熟,周边光晕明显,细胞呈集中分布趋势,免疫荧光方法检测海马神经元的纯度为83.69%±3.55%。(2)应用XhoⅠ和HindⅢ限制性内切酶对突变型CaBP4基因重组质粒(pEGFP-N1- CaBP4mu)和野生型CaBP4基因重组质粒(pEGFP-N1- CaBP4wt)进行酶切,酶切产物琼脂糖凝胶电泳实验结果显示有约为4.72kb和840 bp两个条带,初步鉴定突变型和野生型CaBP4基因重组质粒构建成功,进一步运用基因测序法验证了构建的CaBP4基因重组质粒基因序列与设计序列一致。(3)将突变型和野生型的CaBP4重组质粒分别转染培养了3天的原代海马神经元,分为实验组(转染突变型CaBP4重组质粒的海马神经元)和对照组(转染野生型CaBP4重组质粒的海马神经元),应用倒置荧光显微镜观察转染72小时后实验组和对照组的海马神经元绿色荧光表达情况,实验组的转染效率为11.88%±2.44%,对照组的转染效率为12.09%±2.09%,且实验组的海马神经元出现死亡的数量比对照组的要多。(4)应用膜片钳全细胞记录技术分别对实验组和对照组转染72小时后且有绿色荧光表达的海马神经元进行检测L型钙电流情况,在给予海马神经元相同的步阶刺激后,实验组的L型钙电流比对照组的增大。从两组的I-V曲线可见,两组的海马神经元的L型钙通道约在电压-40mV时开放,当电压达到10mV左右时通道电流达到峰值,实验组的海马神经元的L型钙电流峰值为-13.15±4.35pA(n=5),对照组的海马神经元的L型钙电流峰值为-7.67±5.11 pA(n=6),且实验组的I-V曲线较对照组向超极化的方向下移。(5)应用膜片钳全细胞记录技术分别对实验组和对照组转染72小时后且有绿色荧光表达的海马神经元进行动作电位的检测,发现在相同的阶跃刺激下实验组的海马神经元动作电位的发放频率较对照组的显著增加。[结论](1)应用膜片钳全细胞记录技术首次研究CaBP4基因p.G155D突变在常染色体显性遗传夜间发作性额叶癫痫发病机制中的电生理功能。(2)转染突变型CaBP4重组质粒海马神经元的L型钙电流较对照组内流增多,且动作电位发放频率显著增加。实验结果提示CaBP4基因p.G155D突变可能通过改变CaBP4蛋白结构或功能,影响海马神经元的L-型钙通道对钙离子的调控作用,引起细胞外的钙离子内流增多,进一步触发突触终末神经递质释放增加,从而增强海马神经元的兴奋性,导致癫痫发作。(3)实验组的海马神经元出现死亡的数量较对照组的要多。实验结果提示CaBP4基因p.G155D突变可能通过增加细胞外钙离子内流而导致细胞内钙超载,从而对神经元产生神经元毒性,加重神经元的损伤及促进其死亡
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.1

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本文编号：1146553