局部低剂量X线辐照对BMSCs向周围神经损伤部位归巢影响的实验研究

发布时间：2017-11-20 01:14

  本文关键词：局部低剂量X线辐照对BMSCs向周围神经损伤部位归巢影响的实验研究

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【摘要】：第一部分:大鼠BMSCs的分离、培养、鉴定及染色目的:掌握骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及染色的方法,并对其生物学特性进行初步分析。方法:大鼠处死消毒后,无菌操作取出大鼠双侧股骨、胫骨,暴露骨髓腔,用L-DMEM反复冲洗骨髓腔,收集细胞悬液,离心,弃上清,重悬后计数,接种于的细胞培养瓶内,置于37℃、饱和湿度、5%C02条件下培养,应用全骨髓培养结合差速贴壁法进行细胞分离纯化。待细胞达85%-90%融合时,胰酶消化传代,倒置相差显微镜下观察各代细胞的生长及形态变化。应用流式细胞仪对细胞表面标识进行鉴定。细胞计数法观察并测绘细胞生长曲线图。使用CFDA SE染料对细胞进行染色标记。结果:原代细胞接种培养后2h后,可观察到部分细胞开始贴壁,多呈圆形,折光性较强。1天后可见贴壁细胞增多,常呈圆形、椭圆形,少量梭形。3天后贴壁细胞逐渐呈长梭形、三角或多边形,多形成5-10个细胞的簇状细胞团。2-4天后细胞呈克隆样生长,增殖缓慢,细胞形态逐渐趋于梭形、长梭形,也有少量圆形细胞及多角形细胞。第5-8天时细胞克隆样生长快速,簇状细胞集落迅速增多,并向周围不断扩大。原代培养第10-14天细胞集落可达85%-90%融合,通常表现为鱼群状、旋涡状,即可传代。P2、P4、P6代细胞的生长增殖曲线相接近。取生长状态均一良好的P4代BMSCs,应用流式细胞法进行BMSCs表面抗原标志物鉴定结果为:CD34(0.8%)、CD45(1.3%)阴性;CD29(93.7%)、CD90(99.8%)阳性。结论:应用全骨髓培养结合差速贴壁法能在体外简单、快速的分离和纯化大鼠BMSCs,且增殖迅速、性状稳定。第二部分局部低剂量X线辐照对BMSCs向周围神经损伤部位归巢影响的实验研究目的:设计在小间隙吻合法修复周围神经损伤的基础上,结合局部低剂量X线辐照,通过大鼠尾静脉移植BMSCs,观察低剂量X线辐照对BMSCs向周围神经损伤部位归巢的影响,并探讨其可能的机制。方法:采用健康清洁级2月龄雄性SD大鼠60只,体重250-300g,经小间隙吻合法制成周围神经损伤修复模型后,随机均分为2组,实验组于术后24h行局部1 Gy的X辐照,对照组不予以照射;低剂量辐照干预后1小时,两组大鼠均经尾静脉移植BMSCs。分别于BMSCs移植后24h、48h、96h每组每个时间点各选取6只大鼠,制作冰冻切片,荧光显微镜观察比较两组的BMSCs归巢差异。并通过大鼠一般状态、光镜下神经大体形态、坐骨神经指数、运动神经传导速度、组织学和免疫组织化学、神经透射电镜的超微结构观察比较两组大鼠神经功能的恢复情况。结果:1、各时段大鼠坐骨神经冰冻切片后荧光显微镜下对比观察BMSCs归巢数结果:实验组:24h(+++);48h(++);96h(++)。对照组:24h(++);48h(+);96h(-)。低剂量X线辐照干预后的实验组的BMSCs归巢数明显多于对照组,且表现为细胞移植后24h归巢数最多,随后下降。2、大体观察:(1)两组大鼠均在术后出现患肢瘫痪,各足趾并拢,不能主动展开,踝及足趾下垂致使足背或趾尖触地拖行。实验组大鼠术后均未出现足部溃疡及自噬现象。而对照组大鼠术后2周有4只出现足跟部溃疡,至第4周溃疡完全愈合,无肢体自噬现象。(2)患肢自主活动恢复情况:实验组术后3周开始患肢自主活动,对照组术后5周开始恢复自主活动。3、显微镜下神经吻合口形态观察:实验组中神经损伤处与周围组织粘连明显轻于对照组,且直径与正常神经干无明显差异;而对照组神经直径较正常神经干稍细,且吻合口处表面可见的新生毛细血管明显少于实验组。4、坐骨神经功能指数(SFI):两组大鼠SFI都表现为逐渐恢复,术后4周、8周、12周各时间段实验组SFI恢复均优于对照组,差异有明显统计学意义(p0.05)。5、组织学和免疫组织化学观察:(1)HE染色:实验组和对照组均可见神经纤维通过小间隙到达远端。实验组神经纤维排列、单位面积再生神经纤维密度、轴突肿胀程度等情况均优于对照组。(2)免疫组织化学:实验组抗S-100(+++),对照组抗S-100(++)。实验组雪旺氏细胞增生明显,雪旺氏细胞数目较多。而对照组相对较少。6、神经电生理检测:两组大鼠坐骨神经传导速度都有不同程度的恢复,实验组在6周、12周时坐骨神经传导速度及波幅均高于对照组,差异有明显统计学意义(p0.05)。7、透射电镜观察:每高倍显微镜视野下实验组神经纤维数量、轴突直径、髓鞘形态、神经纤维形态结构均优于对照组。结论:通过尾静脉移植的BMSCs能够归巢至周围神经损伤部位;同时,通过局部低剂量X线辐照干预可明显促进BMSCs向周围神经损伤部位归巢,从而起到促进神经的再生和功能的恢复,但其明确机制还有待进一步研究探讨。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R745

【参考文献】

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1 吴坚;刘炎;王洁;姚健;顾晓松;;自体骨髓间充质干细胞组织工程化神经修复坐骨神经缺损的研究[J];交通医学;2006年06期

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本文编号：1205550