羊种布鲁氏菌外膜蛋白Omp31对小胶质细胞的影响及其分子机制研究

发布时间：2017-11-26 07:04

  本文关键词：羊种布鲁氏菌外膜蛋白Omp31对小胶质细胞的影响及其分子机制研究

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【摘要】：目的构建布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的原核重组质粒p ET-30a-omp31,表达并纯化Omp31融合蛋白,通过检测Omp31融合蛋白刺激小鼠小胶质细胞后细胞因子TNF-α、IL-6及HMGB1的分泌情况及TLR4 m RNA的表达情况,初步探讨布鲁氏菌外膜蛋白Omp31在引起中枢神经系统损伤中所起的作用及HMGB1/TLR4信号转导通路是否介导参与了中枢神经系统损伤的病理过程,并探讨Omp31融合蛋白对小胶质细胞凋亡的影响。方法从Genbank数据库中获得布鲁氏杆菌外膜蛋白Omp31的全基因序列,设计引物,采用PCR技术扩增出Omp31蛋白的基因序列,通过基因克隆技术构建Omp31基因的原核表达载体p ET-30a-omp31,表达、纯化布鲁氏杆菌Omp31融合蛋白,并用不同浓度的Omp31融合蛋白刺激小鼠小胶质细胞,同时设置空白对照组,然后用ELISA方法测定促炎细胞因子TNF-α、IL-6及HMGB1的分泌情况;利用流式细胞仪分析其对小胶质细胞凋亡的影响;用RT-q PCR测定TLR4基因水平的转录与表达。多组均数间的比较采用单因素方差分析,P0.05为差异具有统计学意义。结果经过双酶切及测序验证证明成功构建了Omp31基因的原核表达载体p ET-30a-omp31。通过对原核重组质粒p ET-30a-omp31进行蛋白的诱导表达、纯化得到了Omp31融合蛋白,其融合蛋白的分子量为31k Da左右。将不同浓度的Omp31蛋白刺激小胶质细胞,发现该蛋白能诱导小胶质细胞表达和分泌细胞因子TNF-α,IL-6及HMGB1,其中几乎各组TNF-α,IL-6的分泌量均高于空白对照组,差异有统计学意义(P0.05),1.0ug/ml组、2.5ug/ml组及5.0ug/ml组引起的HMGB1的分泌量同空白对照组相比有统计学意义(P0.05),其蛋白浓度在2.5ug/ml时TNF-α及HMGB1的表达量最高,蛋白浓度在5.0ug/ml时IL-6的表达量最高,之后随着蛋白浓度的增加细胞因子的分泌量逐渐下降。在小胶质细胞中有TLR4 m RNA的表达,其表达量随蛋白浓度不同呈现先增高后降低的趋势,0.5ug/ml组、1.0ug/ml组、2.5ug/ml组及5.0ug/ml组较空白对照组相比均明显增高,差异有统计学意义(P0.05)。经流式细胞学检测发现Omp31融合蛋白能够抑制小胶质细胞的凋亡。结论同空白对照组相比,Omp31融合蛋白刺激组的HMGB1分泌量及TLR4 m RNA的表达量明显上升,同时TNF-α、IL-6的表达也明显上调,说明HMGB1/TLR4信号转导通路被激活,该信号转导通路可能介导参与了Omp31蛋白致中枢神经系统损伤的病理过程。同时布鲁氏菌外膜蛋白Omp31也可能对感染的小胶质细胞的凋亡起着抑制作用。
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.9

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