Necrostatin-1对小鼠脑出血模型血肿周围组织神经保护作用研究

发布时间：2017-11-26 08:26

  本文关键词：Necrostatin-1对小鼠脑出血模型血肿周围组织神经保护作用研究

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【摘要】：目的研究程序性坏死是否参与脑出血后组织病理损害过程,程序性坏死特殊抑制剂Necrostatin-1对血肿周围组织的影响,及其与神经功能恢复的关系。方法①在体实验：随机将ICR小鼠分为正常组、假手术组、脑出血组、Necrostatin-1组和Dmso组。使用Ⅳ型胶原酶左侧基底节注射1μ1制作脑出血模型,假手术组注射等量生理盐水。Necrostatin-1组、Dmso组先在左侧侧脑室分别注射Necrostatin-1、Dmso 1μl预处理,5mi n后再在基底节注射胶原酶1μ1。术后1d、3d、5d、7d取小鼠双侧纹状体组织,利用western blot法检测各组小鼠受体相互作用蛋白酶1(receptor interacting proteinl,RIP1)、受体相互作用蛋白酶3(receptor interacting protein3, RIP3)表达水平变化；采用干湿重法测定术后24h脑组织含水量的变化；利用血红蛋白检测试剂盒检测术后24h两侧大脑半球血红蛋白含量变化；采用改良Garcia评分、转角实验、转棒实验评估小鼠神经功能缺损情况；采用组织免疫荧光法观察术后3d出血侧血肿周围组织少突胶质细胞变化。②离体实验：取孕13.5或14.5天的C57/BL6孕鼠子宫中胎鼠皮层细胞,置于5%CO2,37℃培养箱中培养。48-72小时后,按1：2传代至24孔板,两天后,分为正常组和红细胞裂解液组,红细胞裂解液组加入裂解液10μ1,第三天倒置显微镜下观察红细胞裂解液对少突胶质细胞形态的影响；将培养的少突胶质细胞分为正常组、红细胞裂解液组、Necropstatin-1组和Dmso组,处理1d后,用碘化吡啶(Propidium Iodide, PI)标记坏死细胞并荧光显微镜下观察各组少突胶质细胞变化。结果1在体实验①出血侧RIP1、RIP3蛋白表达：正常组RIP1蛋白有较低表达,假手术组较正常组表达量稍高。脑出血组RIP1蛋白表达1d时即明显升高、3d达到高峰,5d、7d逐渐下降。Necrostatin-1组在相应时间点RIP1蛋白表达较正常组、假手术组高,但低于脑出血组.Dmso组RIP1蛋白表达也很高,高于假手术组、Necrostatin-1组,与脑出血组比较差异不大。RIP3在相应时间点蛋白表达变化与RIP1相同,但表达量没有RIP1蛋白高。②脑组织含水量：正常组脑组织含水量平均约为72%,假手术组约为73.1%,与正常组相比,无显著差异(P0.05)。脑出血组出血侧含水量明显增多,与假手术组比较,差异有统计学意义(P0.05)。Necrostatin-1组出血侧含水量约为75.5%,与假手术组比较也是增多的(P0.05),但明显少于脑出血组(P0.05)。Dmso组出血侧含水量明显增多,与假手术组比较差异有差异(P0.05),与脑出血组比较无统计学意义(P0.05)。③脑组织血红蛋白含量：正常组脑组织血红蛋白含量很低,平均约为0.1μg/m g,假手术组约为0.35μg/mg,与正常组相比,无显著差异(P0.05)。脑出血组出血侧血红蛋白含量明显增多,与假手术组比较,差异有统计学意义(P0.05)。Necrostatin-1组出血侧血红蛋白含量约为0.8μg/mg,比假手术组增高(P0.05),但少于脑出血组(P0.05)。Dmso组出血侧血红蛋白含量比假手术组增多(P0.05),但与脑出血组比较无显著差异(P0.05)。④组织免疫荧光少突胶质细胞变化：正常组少突胶质细胞死亡数目很少,脑出血组出血侧血肿周围组织少突胶质细胞大量死亡,与正常组相比,有显著差异(P0.01)。Necrostatin-1组与脑出血组比较,少突胶质细胞死亡减少(P0.05)。Dmso组出血侧少突胶质细胞也存在大量死亡,与脑出血组比较无显著差异(P0.05)。⑤神经功能缺损：各组小鼠术前改良Garcia评分均在20分左右,无显著差异,术后1d脑出血组、I)mso组、Necrostatin-1组评分均明显降低,各组间差异无统计学意义,Necrostatin-1组4d、7d分值升高,与脑出血组比较差异有统计学意义(P0.05)。术前各组小鼠转角次数无显著差异,术后1d,各组小鼠向损伤侧(左侧)转角次数均增多,4d开始,Necrostatin-1组向损伤侧转角次数减少,与脑出血组比较差异有统计学意义(P0.05)。术前各组小鼠在转轮上时间无差异,1d各组小鼠在轮上时间均缩短,各组间差异无统计学意义,2d至7d,Necrostatin-1组在轮上时间延长,与脑出血组比较差异有统计学意义(P0.05)。2离体实验正常组少突胶质细胞突起较多、细胞形态饱满；加入红细胞裂解液后细胞突起明显减少、细胞发生萎缩。使用PI标记坏死细胞,正常组PI阳性细胞数量较少,细胞裂解液组则可观察到大量的PI阳性细胞(P0.01)。Necrostatin-1组PI阳性细胞数比正常组多(P0.05),但比细胞裂解液组明显减少(P0.05)。Dmso组也存在大量PI阳性细胞,与正常组比较有显著差异(P0.01),与细胞裂解液组比较无统计学意义(P0.05)。结论①程序性坏死可能参与了脑出血后组织病理损伤过程,脑出血后出血部位RIP1、RIP3表达升高,Necrostatin-1可降低脑出血后RIP1、RIP3蛋白的表达。②脑出血后出血侧脑组织含水量、血红蛋白含量增高,Necrostatin-1可降低脑出血后脑组织含水量、血红蛋白含量。③脑出血后血肿周围组织少突胶质细胞发生大量死亡,Necrostatin-1可降低脑出血后血肿周围少突胶质细胞坏死数目,并降低红细胞裂解液引起的少突胶质细胞坏死；红细胞裂解液可能与脑出血后少突胶质细胞程序性坏死有关。④小鼠脑出血后存在神经功能损伤,Necrostatin-1可促进脑出血后小鼠神经功能恢复。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.34

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本文编号：1229192