RGMa对大鼠脑缺血再灌注损伤后血管再生的影响及机制探讨

发布时间：2017-12-01 20:30

  本文关键词：RGMa对大鼠脑缺血再灌注损伤后血管再生的影响及机制探讨

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【摘要】：背景与目的:缺血性脑血管疾病具有高发病率、致残率、死亡率和复发率的特点。卒中后的血管再生是脑梗死后早期代偿的重要过程,能改善局部血流供应、帮助清除坏死组织,为神经元修复、再生创造良好的微环境,从而促进神经功能康复。排斥导向分子a(Repulsive guidance molecule,RGMa)是一种轴突导向因子,与其高亲和力受体Neogenin结合后介导轴突生长抑制、排斥性导向作用,并参与神经增殖、分化、存活等过程。近期研究发现,血管和神经系统具有一定的相似性,它们之间存在一些共同的的分子信号。例如经典的轴突导向因子Netrin家族,参与了血管细胞的黏附、游走、增殖、分化甚至凋亡的调控,在神经和血管发生过程中均能发挥调节作用。最近有研究报道RGMa通过Neogenin下游的FAK去磷酸化抑制人脐动脉内皮细胞(Human umbilical artery endothelial cells,HUAEC)管状结构形成,从而抑制血管生成,但目前关于RGMa在脑缺血损伤后血管系统中的作用尚待阐明。缺血性脑卒中后的血管再生涉及多种细胞生长因子,目前对血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管生成素(Angiopoietin,Ang)家族的功能研究最为深入。VEGF具有促进血管内皮细胞增殖、粘附、迁移和增加血管通透性的生物学活性,ang2与vegf协同作用,触发血管的再生,ang1则促进结构不完整的新生血管形成稳定成熟的血管形态。脑源性神经营养因子(brainderivedneurotrophicfactor,bdnf)除了能促进神经再生,还具有促进血管内皮细胞存活和再生的作用。本课题组前期研究发现应用重组腺病毒rad-shrgma进行特异性rna干扰可显著降低rgma表达。此外,rgma的受体neogenin,胞外结构含有4个免疫球蛋白结构域(4ig)和6个纤维蛋白Ⅲ样结构域(6fnⅢ),有文献报道6fnⅢ是neogenin上与rgma结合的区域。因此本研究采用重组腺病毒对缺血再灌注大鼠脑组织rgma的转录进行rna干扰,从而抑制rgma表达,观察血管再生情况,探讨rna干扰rgma对大鼠局灶性缺血再灌注后血管再生的影响。后期研究中采用6fnⅢ对rgma/neogenin通路进行干预,观察大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血皮质vegf、ang1、ang2、bdnf的表达水平,探讨rgma对大鼠脑缺血再灌注损伤后血管再生影响的潜在的机制。方法:1.将25只雄性sd大鼠随机分为假手术组(s)、脑缺血组(i/r)、脑缺血+重组腺病毒干预组(i/r+rad-shrgma)及脑缺血+空载体腺病毒注射组(i/r+rad-hk),脑缺血组(i/r)再分为2天和7天亚组。颅内立体定位注射腺病毒建立rna干扰rgma重组腺病毒转染动物模型后,立即行大脑中动脉闭塞(mcao)/再灌注手术。于再灌注后第2天进行免疫荧光定位rgma及其受体neogenin在缺血脑组织神经元、血管内皮细胞上的表达;rna干扰rgma后第7天进行免疫组化法标记cd31计数缺血侧皮质微血管数,免疫荧光双标ki67/cd31观察缺血侧皮质血管内皮细胞增殖情况;所有大鼠在处死前进行神经功能评分。2.将30只雄性sd大鼠随机分成假手术组(s)、脑缺血组(i/r)、脑缺血+6fnⅢ不同浓度干预组(i/r+6fnⅢ(h):1μg/μl;i/r+6fnⅢ(m):0.5μg/μl;i/r+6fnⅢ(l):0.25μg/μl)及脑缺血+生理盐水对照组(i/r+ns)六个组,分别予以等体积不同浓度梯度的6fnⅢ或生理盐水进行侧脑室注射,通过蛋白质印迹实验检测rgma的蛋白表达水平,探索6fnⅢ的最佳给药浓度。然后,将90只大鼠随机分为假手术组(s)、脑缺血组(i/r)、脑缺血+重组腺病毒干预组(i/r+rad-shrgma)、脑缺血+6fnⅢ组(i/r+6fnⅢ)、脑缺血+空载体重组腺病毒注射组(i/r+rad-hk)及脑缺血+生理盐水对照组(i/r+ns)六组,各组再分为2天、7天、14天亚组。蛋白质印迹实验检测再灌注后第2、7、14天缺血侧皮质vegf、ang1、ang2、bdnf蛋白表达水平。结果:1.在脑缺血再灌注损伤后,rgma及其受体neogenin在神经元、血管内皮细胞上均有表达;rna干扰抑制rgma表达后,微血管数量明显增多,血管内皮细胞增殖明显,神经功能缺损明显改善。2.6fnⅢ能显著降低rgma蛋白水平,其作用与浓度呈正相关,且中浓度组与高浓度组间无统计学差异,选择中浓度组6fnⅢ(0.5μg/μl)作为给药浓度;6fnⅢ干预组与rna干扰rgma腺病毒组vegf、ang1、ang2、bdnf的蛋白表达水平均较对照组明显升高。结论:1.RGMa可能在缺血再灌注损伤后血管再生过程中发挥负性调节作用,采用重组腺病毒rAd-shRGMa进行RNA干扰抑制RGMa表达则能促进血管的再生,改善神经功能障碍。2.外源性6FNⅢ肽段能有效降低RGMa蛋白水平,干预RGMa/Neogenin通路;RGMa可能通过受体Neogenin在缺血再灌注损伤后拮抗VEGF、Ang1、Ang2、BDNF表达从而对血管再生过程发挥负性调节作用。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3

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本文编号：1242379