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人水离子通道蛋白4的表达及在视神经脊髓炎诊断中的应用

发布时间:2017-12-09 02:12

  本文关键词:人水离子通道蛋白4的表达及在视神经脊髓炎诊断中的应用


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【摘要】:背景视神经脊髓炎(neuromyelitis optica,NMO)是中枢神经系统(central nervous system,CNS)的严重性脱髓鞘疾病,主要损伤视神经和脊髓,多起病急骤且进展迅速,严重危害人类的健康。自1894年NMO这一概念被提出以来,对于NMO是一独立的疾病还是多发性硬化(mutiple sclerosis,MS)的亚型一直存在较大的争议。2004年Lennon等发现抗水离子通道蛋白4(aquaporin-4,AQP4)抗体是NMO的特异性致病抗体,从而证明了NMO是不同于MS的一种体液免疫介导的自身免疫性疾病。由于NMO和MS的治疗和预后存在较大的差异,因此,检测疑似病例血清中的抗AQP4抗体水平对于NMO和MS的鉴别诊断、治疗及预后判断具有明显的指导意义。迄今为止国内尚缺乏灵敏度高和特异性强的试剂盒用于检测AQP4抗体,建立一种适用于国人NMO中自身抗体的检测方法是非常有必要的。目前已经证明该抗体的主要结合位点是其靶抗原AQP4的胞外区,克隆表达AQP4的胞外区有望为抗AQP4抗体的检测提供原料。另外通过真核表达系统表达AQP4全长蛋白,比较原核表达胞外区蛋白和真核表达全长蛋白在检测AQP4抗体中的差异。目的1.通过构建p ET32a(+)-AQP4的胞外区的原核表达质粒,表达AQP4的胞外区蛋白,建立一种可用于检测AQP4抗体的ELISA方法。2.利用重组质粒p CMV6-AC-GFP-AQP4转染HEK293细胞,表达AQP4全长蛋白,建立用于检测抗AQP4抗体的CBA方法。方法1.利用生物信息学软件TMHMM 2.0分析人AQP4的结构,并根据大肠杆菌的密码子的偏好性设计合成AQP4胞外区的寡核苷酸序列。2.利用分子克隆技术构建p ET32a(+)-AQP4胞外区的原核表达质粒。3.构建的重组表达质粒通过转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用IPTG进行诱导表达蛋白,然后通过SDS-PAGE电泳分析表达产物。4.大规模培养宿主菌并诱导表达目的蛋白,利用Ni2+离子亲和层析技术进行蛋白质的纯化,目的蛋白经过SDS-PAGE电泳和Western blot的鉴定。5.利用纯化酶切的目的蛋白包被ELISA微孔板,通过国际公认检测AQP4抗体的金标准间接免疫荧光法筛选的阳性血清对表达蛋白的生物活性进行评估。6.通过脂质体转染技术将重组质粒p CMV6-AC-GFP-AQP4转染HEK293细胞,并同时用p CMV6-AC-GFP转染细胞作为对照。对转染细胞进行固定后进行后通过间接免疫荧光法检测NMO患者患者血清中的抗体。结果1.限制性内切酶和测序分析均鉴定重组表达质粒构建正确。2.经过SDS-PAGE电泳鉴定,构建的p ET-32a(+)-AQP4胞外区的原核表达质粒的宿主菌经诱导表达的蛋白可以可溶性的表达形式在菌体的上清中表达,其相对分子量均在26KD左右。3.诱导表达的蛋白均可经过一步亲和层析达到较高的纯度。4.诱导表达的蛋白均可与抗His-tag的抗体进行特异性的结合。5.表达的AQP4的胞外区不能与抗AQP4抗体特异性结合。6.转染GFP空质粒的细胞绿色荧光充满整个细胞,而转染GFP-AQP4的细胞绿色荧光仅定位于细胞膜。7.转染GFP-AQP4的细胞能与NMO患者血清中的抗AQP4抗体特异性结合。结论1.成功构建了p ET-32a(+)-AQP4胞外区的原核表达质粒并获得了一定纯度的蛋白,为后续用于视神经脊髓炎的体外诊断奠定了基础。2.仅表达AQP4的胞外区蛋白,不能与抗AQP4抗体进行特异性结合,这可能与破坏了AQP4的三维空间结构及自身是否形成OAP结构相关。
【学位授予单位】:郑州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R744.52

【共引文献】

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本文编号:1268694

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