盐酸阿比多尔减轻水通道蛋白-4抗体阳性血清的神经毒性作用：体内外实验研究

发布时间：2017-12-09 19:08

  本文关键词：盐酸阿比多尔减轻水通道蛋白-4抗体阳性血清的神经毒性作用：体内外实验研究

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【摘要】：目的:视视神经脊髓炎(Neuromyelitis optica,NMO)是一种中枢神经系统炎性脱髓鞘性自身免疫性疾病,常常引起视力下降和局灶神经功能缺损。其主要发病机制是水通道蛋白4(aquaporin-4,AQP4)抗体与星形胶质细胞足突上的AQP4特异性结合诱发抗体依赖的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)和补体依赖的细胞毒性(Complement-dependent cytotoxicity,CDC)作用,引起炎性反应,血脑屏障破坏,从而导致髓鞘脱失,星形胶质细胞和神经元坏死。目前NMO治疗方法相对单一,主要包括免疫抑制剂,免疫调节剂和血浆置换,尚不能有效的预防NMO复发,且均未涉及其发病机制。近来,应用AQP4转染细胞及小鼠NMO模型研究发现小分子抑制剂-盐酸阿比多尔能够阻断AQP4抗体与AQP4的特异性结合,并有效减轻AQP4抗体介导的CDC及ADCC作用。而阿比多尔在原代皮层混合培养和大鼠体内NMO模型的作用如何尚未见报道,因此我们应用SD(Sprague-Dawley)大鼠大脑皮层原代混合培养细胞及大鼠脑内注射模型观察盐酸阿比多尔在体内外对AQP4抗体神经毒性的作用。方法:常规培养新生SD大鼠大脑皮层细胞,用含有10%体积胎牛血清DMEM/F12制备成单细胞悬液,并种植于预先包被有多聚赖氨酸的培养板(或24孔板)中,置37℃5%CO2细胞培养箱中培养,分别于24h、72h换液,培养4d的细胞用于实验。实验随机分为4组,①正常血清组:原代培养大鼠皮层神经细胞4d后给予10%体积正常对照血清;②AQP4抗体阳性血清组:原代培养大鼠皮层神经细胞4d后给予10%体积抗体阳性性血清;③阿比多尔预处理组:阿比多尔依据12.5μM、25μM、50μM不同浓度分3个亚组。原代培养大鼠皮层神经细胞4d,分别加不同浓度阿比多尔处理1h后给予10%体积抗体阳性性血清;④二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)对照组(1%DMSO),原代培养大鼠皮层神经细胞4d,加入等体积DMSO预处理1h,各组细胞再培养6h后进行Hoechst33258/碘化丙啶(propidium iodide,PI)双染筛查阿比多尔最合适浓度,选取③中最有效浓度组及其余各组行细胞免疫荧光染色,观察星形胶质细胞和神经元变化。另使用SD大鼠脑内注射AQP4阳性血清制备NMO动物模型,选取24只SD成年大鼠随机分为4组,分别给予右侧脑内注射40μL正常人血清,右侧脑内注射40μL AQP4抗体阳性血清,腹腔注射浓度为10mg/ml的阿比多尔(54mg/kg)干预3h后右侧脑内注射40μL抗体阳性血清,腹腔注射等体积浓度的DMSO预处理3h后右侧脑内注射40μL抗体阳性血清,各组大鼠继续饲养3天后断头取脑,冠状切片,分别进行HE及免疫组织化学染色观察灶局部炎性细胞及AQP4和神经胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达的变化,并测量病灶大小。结果:1筛查盐酸阿比多尔最有效浓度正常血清组及DMSO对照组均无明显的细胞坏死,而AQP4抗体阳性血清组细胞坏死明显;分别给予12.5μM、25μM、50μM浓度的盐酸阿比多尔预处理坏死细胞均减少,以上各组总体比较差异有统计学意义(χ2=261.7,P0.05),组间比较显示12.5μM与25μM的阿比多尔预处理组细胞存活率(64.24%和78.92%)分别与AQP4抗体阳性血清组(48.62%)比较差异有统计学意义(P均0.01),而50μM阿比多尔预处理组存活率为(36.32%),与AQP4抗体阳性血清组比较差异无统计学意义(P=0.014)。2阿比多尔预处理对原代培养大鼠皮层星形胶质细胞和神经元的影响AQP4抗体阳性血清组星形胶质细胞和神经元单个视野阳性细胞总面积分别为405.17±79.41μm2和295.26±43.31μm2均较正常血清对照组3226.85±334.56μm2和1990.03±63.27μm2明显减少,差异有统计学意义(P均0.01);阿比多尔预处理组星形胶质细胞和神经元阳性细胞总面积分别为1086.17±148.31μm2和955.75±132.05μm2,明显高于AQP4抗体阳性组,差异有统计学意义(P均0.01),而DMSO组星形胶质细胞和神经元阳性细胞总面积(2903.61±162.50μm2和1864.10±67.39μm2)与正常血清组比较差异无统计学意义(P=0.102)。3脑内注射AQP4抗体阳性血清产生类似NMO病灶改变HE染色显示注射部位周围可见广泛的炎性细胞侵润,而对侧炎性细胞反应不明显。免疫组织化学染色示AQP4抗体阳性血清引起病灶内AQP4和GFAP表达显著缺失,病灶周围GFAP表达显著增加,正常血清组仅针道周围GFAP表达活性增加,AQP4表达未见明显缺失。4盐酸阿比多尔预处理减少GFAP与AQP4表达缺失范围脑内注射AQP4抗体阳性血清GFAP和AQP4染色缺失面积分别为15.5864±0.72756和18.0692±1.21775(mm2),较正常血清组4.6205±0.3178和3.8589±0.28073明显增加,差异有统计学意义(P均0.05);和AQP4抗体阳性血清组比较,盐酸阿比多尔预处理组GFAP和AQP4染色缺失面积9.7107±0.41437和8.3793±0.59119明显减少,差异有统计学意义(P均0.05)。结论:1 SD大鼠脑内注射NMO患者AQP4抗体阳性血清能够诱导病灶炎性细胞浸润,AQP4和GFAP表达缺失。2阿比多尔在体内外均能减轻AQP4抗体血清的毒性作用。3阿比多尔可能用于治疗NMO。3脑内注射AQP4抗体阳性血清产生类似NMO病灶改变
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R744.52

【参考文献】

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本文编号：1271508