小胶质细胞微环境对神经干细胞分化为多巴胺能神经元的影响

发布时间：2017-12-14 18:11

  本文关键词：小胶质细胞微环境对神经干细胞分化为多巴胺能神经元的影响

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【摘要】：目的：本文通过体外实验来研究小胶质细胞微环境对神经干细胞分化为多巴胺能神经元的影响,并初步探讨其可能的相关作用机制,为帕金森病的细胞移植治疗提供实验基础。方法：1.神经干细胞(NSCs)分离、培养、鉴定：取怀孕14-15天的SD胎鼠,显微镜下分离中脑,经胰蛋白酶消化分离制成细胞悬液,加入B27、EGF、bFGF经计数、调整细胞浓度后无血清培养。Nestin细胞免疫化学鉴定神经干细胞后按时半量换液培养备用。2.小胶质细胞分离、培养、鉴定：取新出生1天的SD大鼠,分离皮质脑组织,经机械分离和胰蛋白酶消化分离制成细胞悬液,细胞计数后调整细胞浓度接种培养数天。根据巨噬细胞分化抗原-1(Mac-1)鉴定阳性细胞,调整细胞浓度按时半量换液培养备用。3.小胶质细胞与NSCs共培养：采用Transwell系统,下层培养小胶质细胞,上层培养NSCs,分组如下：(1)NSCs单独培养；(2)正常小胶质细胞与NSCs以1：4比例共培养。共培养3d、6d、9d后观察NSCs的存活及是否向多巴胺能(DA)神经元分化等。4.检测NSCs向DA神经元的分化情况：采用实时荧光PCR、Western Blot、免疫细胞化学法检测DA能神经元分化和成熟相关基因及蛋白(VMAT2, DAT, TH, FOX2, Pitx3, Lmx1a, Otx2)的表达。结果：1.体外细胞培养结果显示：神经干细胞培养过程中可见折光性良好悬浮生成的典型神经球,部分贴壁生长,Nestin鉴定阳性；小胶质细胞培养过程中可见细胞分层现象,Mac-1鉴定阳性,可用于后续试验。2.实时荧光PCR检测到共培养组比单独神经干细胞组DAT、FOXA2、Lmx1a、 Otx2、Pitx3、TH、VAMT2基因中mRNA表达均呈现不同程度上调(P0.05),具有统计学意义。3.Western Blot检测到共培养组与多巴胺能神经元成熟相关的蛋白较单独培养组明显增加(P0.05),有统计学意义。4.免疫细胞化学检测可看到共培养组荧光信号较单独培养组增强,与Western B1ot结果相一致。结论：我们从SD大鼠脑组织中成功分离、培养出神经干细胞和小胶质细胞,nestin可作为神经干细胞的鉴定,MAC-1可作为小胶质细胞的鉴定。小胶质细胞通过促进神经干细胞Pitx3、Otx3、TH、Lmx1a、Vmat2、DAT、Foxa2基因的表达实现向巴胺能神经元的分化、成熟。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5

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