TRIF信号在原代星形胶质细胞炎症因子释放中的作用及机制

发布时间：2017-12-14 19:38

本文关键词：TRIF信号在原代星形胶质细胞炎症因子释放中的作用及机制

【摘要】：在中枢神经系统中,星形胶质细胞(Astrocyte,AS)是分布最广泛的细胞,而且是数量最多的细胞,它具有复杂多样的结构与功能,在分泌营养物质、调节神经元微环境等方面均发挥了重要功能[1,2],参与了多种神经系统退行性疾病的病情发生和病理过程。近年来的研究表明,星形胶质细胞也具有免疫功能,星形胶质细胞在脑内调节免疫功能则主要是通过产生炎症细胞因子来发挥重要的作用[3]。Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)是一类非常重要蛋白质分子,它参与了非特异性免疫(天然免疫)的反应,也是连接着非特异性免疫以及特异性免疫的枢纽。在中枢神经系统,TLRs主要存在并表达于小胶质细胞和巨噬细胞中[4.5],但是在星形胶质细胞中也有表达。星形胶质细胞在炎症方面的效应可能与TLRs有关。目的:本实验研究在原代培养的星形胶质细胞中,通过诱导刺激使星形胶质细胞活化,观察星形胶质细胞炎症因子分泌的不同变化,并观察这种变化与TRIF信号通路的联系,进而探讨TRIF信号通路对星形胶质细胞炎症反应的影响。方法:1.原代星形胶质细胞的培养:使用新生1-2天的C57乳鼠,取大脑皮层制备原代星形胶质细胞,传代3次,星形胶质细胞传代时取少量细胞种植于24孔板内玻片上,24 h后,待细胞完全贴壁时使用多聚甲醛固定,进行兔抗GFAP多克隆抗体的免疫细胞化学鉴定培养细胞,同时利用CD11b抗体检测小胶质细胞,并用TRIF以及TLR3抗体进行检测观察。星形胶质细胞纯度计数高于95%时用于后续实验。2.实验分为四组:(1)对照组:常规培养的星形胶质细胞,不经过任何处理;(2)LPS处理组:用脂多糖(LPS)(100ng/ml)处理细胞24小时,利用荧光定量PCR观察iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β的表达变化;(3)IL-4处理组:用白细胞介素-4(IL-4)(20ng/ml)处理细胞24小时,利用荧光定量PCR观察ARG1、CD206、IL-10、IFN-β、TNF-α、IL-6的mRNA表达变化;(4)Poly(I:C)处理组:用Poly(I:C)(25μg/ml)处理细胞24小时,利用荧光定量PCR观察IL-6、iNOS、TNF-α、IL-1β、ARG1、CD206、IL-10、IFN-β、CD68的mRNA表达变化。3.敲降TRIF后炎症因子的表达:利用siRNA转染原代培养的星形胶质细胞,获得TRIF表达量特异性下降的星形胶质细胞,分别用LPS、IL-4处理敲降TRIF以及未敲降TRIF的星形胶质细胞。比较敲降TRIF前后所分泌的炎症因子mRNA水平表达的变化。结果:1.免疫组化结果显示,经过3次传代后,GFAP阳性标记的原代培养的星形胶质细胞纯度计数可达95%,CD11b检测基本未见阳性标记,可排除小胶质细胞的影响。TRIF以及TLR3抗体检测,部分细胞标记阳性。2.Q-PCR结果显示,利用LPS处理后,炎症促进因子IL-6、iNOS、TNF-α等mRNA表达上升。用IL-4刺激后,炎症抑制因子ARG1、CD206、IL-10等mRNA表达上升;促炎因子TNF-α和IL-6的mRNA表达下降。用Poly(I:C)刺激后,促炎因子IL-6、iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表达以及抑炎因子ARG1、CD206、IL-10、IFN-β、CD68的mRNA表达均升高。3.Q-PCR结果表明,siRNA转染敲降TRIF原代培养的星形胶质细胞24小时后,在IL-4的刺激下,可见Arg1和CD206的mRNA表达在敲除TRIF之后明显下调,TNF-α和IL-6的mRNA表达在敲除之后(siTRIF+IL-4组)较siNC+IL-4组则上升;在siRNA转染原代培养的星形胶质细胞24小时后,利用LPS刺激,IL-6、TNF-α、iNOS、IL-1β的表达在敲除之后的LPS处理组(siTRIF+LPS组)较siNC+LPS组都明显下降。主要结论:1.用出生1-2天的C57乳鼠,经过3次传代,能培养出纯度高于95%的原代星形胶质细胞,可排除小胶质细胞的影响,且TLR3以及TRIF在星形胶质细胞中也有表达。2.利用LPS、IL4、Poly(I:C)刺激原代星形胶质细胞后,各种炎症因子的mRNA表达变化均有明显变化,证实原代星形胶质细胞可被LPS、IL4、Poly(I:C)等诱导而活化。3.敲降原代星形胶质细胞的TRIF后,再分别用IL4和LPS刺激,各炎症因子的mRNA变化可有明显的升高或者降低,证实TRIF信号通路在星形胶质细胞的活化过程中起重要作用。
【学位授予单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R741

【参考文献】

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