EGCG对实验性蛛网膜下腔出血后线粒体质量调控的分子机制研究

发布时间：2017-12-20 23:06

  本文关键词：EGCG对实验性蛛网膜下腔出血后线粒体质量调控的分子机制研究　出处：《新乡医学院》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：背景蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)最常见病因为动脉瘤破裂和脑血管畸形,具有高致死率、高致残率等特点。在诸如阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)、帕金森病(Parkinson's disease, PD)和肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)等神经退行性疾病中,受损线粒体的质量调控影响神经元的存活。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是绿茶多酚的主要成分,其在癌症、炎性疾病、心血管疾病以及神经退行性疾病中的保护作用日益受到关注。本研究选择具有交感神经元特性的PCI2细胞建立体外SAH模型,旨在观察,EGCG对SAH后交感神经元线粒体损伤是否有保护作用,并从线粒体质量调控的角度探讨EGCG的作用机制。方法1.制备PCI2细胞SAH模型,用MTT法筛选出EGCG的最佳保护浓度(50μmol/L)。2.选对数生长期的细胞随机分为3组：1：对照组；2：SAH模型组；3：EGCG 50μmol/L保护组。应用线粒体膜电位和活性氧检测试剂盒,检测EGCG对SAH细胞模型的线粒体保护作用。3.应用qRT-PCR方法检测线粒体质量调控：线粒体分裂和融合基因FIS1、 MFN1、OPA1及PINK1、PARKIN的表达。4.应用透射电镜观察EGCG对SAH细胞模型自噬的影响；应用qRT-PCR法检测自噬相关基因ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅱ等的表达。结果1.EGCG预适应后维持神经细胞正常生长。SAH组细胞活力明显升高,与对照组相比具有显著的统计学意义(P0.01)：不同浓度的EGCG预处理后,EGCG呈剂量依赖方式抑制SAH后细胞增殖,与SAH组相比,1μmol/L组具有统计学意义(P0.05),5、10、25、50 μmol/L组具有显著统计学意义(P0.01)。2. EGCG保护SAH后线粒体功能。荧光显微镜观察线粒体膜电位的变化发现,正常组细胞以红色荧光为主,SAH后细胞内红色荧光减少,绿色荧光增多,提示线粒体膜电位在SAH后发生了去极化。EGCG预适应后细胞内荧光恢复到了以红色为主、绿色减少的形式,提示EGCG维持了SAH后线粒体膜电位的正常状态。荧光显微镜下,正常组细胞内可见红色荧光,SAH组较正常组红色荧光明显减少,EGCG组细胞内红色荧光量较SAH组明显增加,接近于正常对照组。定量分析显示,线粒体膜电位去极化在SAH组变化明显,与空白对照组相比有统计学意义(P0.05)；以50μmol/L EGCG预处理后,与SAH组相比,线粒体膜电位升高显著(P0.01),与正常细胞组相比,具有显著统计学意义(P0.01)。ROS主要由细胞内线粒体产生,以荧光显微镜观察ROS在细胞内的含量变化显示,SAH后ROS荧光增加,EGCG可拮抗这一变化。定量分析显示,ROS在SAH组显著性升高(P0.01),EGCG预处理后,活性氧水平较SAH组明显降低(P0.01),较正常细胞组有显著性意义(P0.01)。3. EGCG对线粒体质量调控的作用：qRT-PCR法检测发现,SAH组线粒体分裂和融合基因FIS1、MFN1、OPA1基因表达量较正常组升高,FIS1表达较正常组具有统计学意义(P0.05)；EGCG组FIS1、MFN1、OPA1基因表达较SAH组降低。PINK1和PARKIN基因在SAH组表达增加,PARKIN与空白对照组相比有显著统计学差异(P0.01)；EGCG组PINK1 表达量降低,较正常对照组和SAH组均具有统计学意义(P0.01)；PARKIN表达量较SAH无明显变化,较正常对照组有统计学意义(P0.01)。4. EGCG对细胞自噬的影响：透射电镜发现,SAH组和EGCG组均可见较多的自噬小体形成,自噬体内可见双层膜结构的线粒体存在,EGCG预处理组自噬小体数量较SAH组减少。qRT-PCR法检测发现,与正常组相比,SAH组BECLIN1、 LC3-Ⅱ基因mRNA表达量增加,但ATG5基因表达量降低；EGCG预处理后,自噬相关基因表达均降低(P0.05)结论EGCG通过线粒体质量调控机制,依赖自噬途径发挥SAH后的线粒体保护作用。
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.34

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本文编号：1313734