组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA调控Keap1-Nrf2信号通路的相关机制研究

发布时间：2018-01-22 23:09

  本文关键词： 核相关因子2 Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1 曲古抑菌素A 重组质粒 蛋白酶体途径 溶酶体途径　出处：《南京大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景：细胞防御的一个重要机制就是Keap1-Nrf2信号通路的激活。生理状态下,Keap1 (Kelch-like ECH-associated proteinl)作为Cul3依赖性E3 (ubiquitin-protein ligase)泛素连接酶复合物的衔接蛋白,介导转录因子Nrf2 (NF-E2-related factor 2)泛素化,被26S蛋白酶体降解。在应激或伤害条件下,Nr-2与Keap1解偶联并转入细胞核内,调节其下游靶基因表达。因此,胞质蛋白Keap1对于Nrf2的激活具有重要意义。催化蛋白去乙酰化的组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDAC)被认为可能是治疗许多人类疾病的有用靶点,包括中枢神经系统疾病。研究表明,HDAC抑制剂能够通过激活lKeap1-Nrf2通路,发挥神经保护作用,但是对其激活机制目前尚未完全阐明。本研究旨在探讨在RAW 264.7细胞中,HDAC抑制剂TSA调控Keap1-Nrf2信号通路的可能作用机制。研究目的：1、确认TSA可以激活Keap1-Nrf2通路；2、构建真核重组质粒pcDNA3.1-6cmyc-Keap1(1-624), pcDNA3.1-6cmyc-Keap1(1-314)和pcDNA3.1-6cmyc-Keap1(315-624),研究TSA作用于Keap1的可能功能片段；3、研究TSA是否能够通过蛋白水平调控Keap1。若能,则进一步探讨TSA促进Keap1蛋白降解的可能途径。研究方法：1、培养RAW 264.7细胞,利用不同浓度的TSA(10ng/ml,30ng/ml, 100ng/ml)处理细胞16h, Western Blot法检钡Keap1、 Nrf2、 HO1和NQO1蛋白表达水平；RT-PCR法检钡Keap1 mRNA表达水平；2、培养RAW 264.7细胞,利用一定浓度的TSA(30ng/ml)处理细胞4h,免疫荧光法检测Nrf2的核易位情况。3、利用限制性内切酶和DNA测序对构建的重组质粒进行鉴定；4、培养RAw 264.7细胞,TSA(30ng/ml)和ActD(0.5ug/ml)共处理细胞12h, Western Blot检测]Keap1蛋白表达情况,RT-PCR检钡Keapl mRNA表达情况；5.Lipo 2000转染RAW264.7细胞,TSA (30ng/ml)处理16h,收集转染48h的蛋白,外源性Keap1蛋白表达水平利用Western Blot法检测；6、培养RAW 264.7细胞,TSA (30ng/ml)和MG-132(5umol/L)/3-MA (5mmol/L)共处理细胞12h,免疫印迹法检钡Keap1蛋白表达水平。研究结果：1、TSA抑制内源性Keap1蛋白和mRNA表达水平,且这种抑制作用具有剂量和时间依赖性；2、TSA促-Nrf2核易位,同时上调其下游蛋白表达；3、重组质粒经过酶切鉴定和DNA序列比对,证实构建成功；4、TSA和ActD共处理后,Keap1蛋白表达明显减少,而Keap1 mRNA水平无明显变化；5、TSA促进外源性Keap1蛋白降解；6、蛋白酶抑制剂MG-132和自噬抑制剂3-MA不影响TSA对Keap1蛋白的降解。结论：HDAC抑制剂TSA能够抑制Keap1表达,激活Nrt2,引发下游反应。TSA不仅可以通过转录水平抑制Keap1表达,还能从蛋白水平抑制其表达,即TSA可以直接促进Keap1蛋白降解,而导致Keap1蛋白降解的途径有可能不依赖蛋白酶体途径和溶酶体途径,详细机制仍有待进一步研究。
[Abstract]:Background: one of the important mechanisms of cell defense is the activation of Keap1-Nrf2 signaling pathway. Keap1 Kelch-like ECH-associated protein 1 as a Cul3 dependency E _ 3 (. Ubiquitin-protein ligase) the binding protein of the ubiquitin ligase complex. The transcriptional factor Nrf2 / NF-E2-related factor 2) is ubiquitized and degraded by 26s proteasome under stress or injury conditions. Nr-2 is uncoupled with Keap1 and transferred into the nucleus to regulate its downstream target gene expression. Cytoplasmic protein Keap1 plays an important role in the activation of Nrf2. Histone deacetylases catalyzes the deacetylation of proteins. HDAC) may be a useful target for the treatment of many human diseases, including central nervous system diseases. Studies have shown that HDACs inhibitors can activate the lKeap1-Nrf2 pathway. This study was designed to explore the role of neuroprotective effect in RAW 264.7 cells, but the mechanism of its activation has not been fully elucidated. The possible mechanism of Keap1-Nrf2 signaling pathway regulated by HDAC inhibitor TSA. Objective: to confirm that TSA can activate Keap1-Nrf2 pathway; 2.Eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1-6cmyc-Keap11-624) was constructed. PcDNA3.1-6cmyc-Keap1 (1-314) and pcDNA3.1-6cmyc-Keap1 (315-624). The possible functional fragments of TSA acting on Keap1 were studied. 3. To study whether TSA can regulate Keap1 through protein level, and if so, to further explore the possible pathway of TSA promoting Keap1 protein degradation. RAW 264.7 cells were cultured and treated with different concentrations of TSA 10 ng / ml 30 ng / ml, 100 ng / ml for 16 h. The expression levels of barium Keap1, Nrf2, HO1 and NQO1 protein were detected by Western Blot method. The expression of barium Keap1 mRNA was detected by RT-PCR method. 2. RAW 264.7 cells were cultured and treated with a certain concentration of TSA 30 ng / ml for 4 h. The nuclear translocation of Nrf2 was detected by immunofluorescence method. The recombinant plasmid was identified by restriction endonuclease and DNA sequencing. (4) RAw 264.7 cells were co-treated with TSA 30 ng / ml and ActDX 0.5 g / ml for 12 h. The expression of Keap1 protein was detected by Western Blot. The expression of barium Keapl mRNA was detected by RT-PCR. 5. The RAW264.7 cells were transfected with Lipo 2000 for 16 h and the protein was collected after transfection for 48 h. The expression of exogenous Keap1 protein was detected by Western Blot. 6. The cells were co-treated with RAW 264.7 cells at 30 ng / ml and 5 mmol / L MG-132(5umol/L)/3-MA for 12 h. The expression of barium Keap1 protein was detected by Western blotting. Results the expression of endogenous Keap1 protein and mRNA was inhibited by 1: 1 TSA in a dose-and time-dependent manner. 2TSA promoted the nuclear translocation of -Nrf2 and up-regulated its downstream protein expression. 3. The recombinant plasmid was successfully constructed by restriction endonuclease digestion and DNA sequence alignment. 4After co-treatment of TSA and ActD, the expression of Keap1 protein decreased significantly, but the level of Keap1 mRNA did not change significantly. 5TSA promoted the degradation of exogenous Keap1 protein; 6. Protease inhibitor MG-132 and autophagy inhibitor 3-MA did not affect the degradation of Keap1 protein by TSA. Conclusion TSA can inhibit the expression of Keap1. Activation of Nrt2, initiation of downstream reaction. TSA can not only inhibit the expression of Keap1 through transcription level, but also inhibit its expression from the protein level, that is, TSA can directly promote the degradation of Keap1 protein. However, the pathway leading to the degradation of Keap1 protein may not depend on the proteasome pathway and lysosomal pathway, and the detailed mechanism remains to be further studied.
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R741

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本文编号：1455983