HIF-1在实验性SAH早期脑损伤中的调控及槲皮素作用研究

发布时间：2018-01-24 21:03

本文关键词： 蛛网膜下腔出血低氧诱导因子-1 槲皮素早期脑损伤海马凋亡血脑屏障氧化应激脑水肿脑血管痉挛　出处：《第四军医大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage, SAH）的死亡率和致残率都比较高，而且病例机制复杂。除了我们熟知的72小时脑血管痉挛（cerebral vasospasm, CVS）后脑缺血造成严重的迟发性脑损伤（delayed brain injury, DBI）外。最近研究发现，72小时内的早期脑损伤（early brain injury, EBI）包括脑灌注压（cerebral perfusionpressure, CPP）下降、离子失衡、谷氨酸毒性、氧化应激、炎性反应、血管内皮损伤、血小板活化和聚集、通透性改变、细胞死亡通路激活等一系列的病理生理反应，导致认知障碍、神经功能缺陷等，这对SAH的整体预后非常关键，，并且，其中的分子机制是研究热点。低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1, HIF-1）是氧敏感的转录调节因子，它调控的下游靶基因有70多个，包括血管内皮生长因子、促红细胞生成素、葡萄糖转运体等等。HIF-1包括HIF-1和HIF-1β两个亚基，已有研究显示在局灶性脑缺血损伤动物模型中上调HIF-1的表达可以起到神经保护作用，但是在SAH中关于HIF-1的表达调控以及它发挥的作用还没有明确的报道。HIF-1的特异性抑制剂有叫YC-1的化合物，它的激动剂除了低氧环境外，已有少部分实验发现槲皮素可以上调HIF-1的表达。槲皮素是黄酮类的成份之一，它有明确的分子式，不同的化学基起到不同的作用，它具有清除氧自由基（oxygen free radicals, ROS）、抑制脂质过氧化（lipid peroxides, LPO）的抗毒抗氧化应激的作用，螯合钙、铁等离子以及修复损伤DNA的神经保护等作用。在欧美等国家已经作为药物上市，国内应用的银杏叶提取物、银杏达莫注射液等药物，其中最重要的成份就是槲皮素，但是关于槲皮素在SAH中的作用及其机制尚未见到国内外报道。因此，深入研究HIF-1及槲皮素在SAH后早期发挥的机制及它们的相互作用，对加强SAH后EBI的保护有一定的作用。本研究共分五部分实验，实验一是关于HIF-1在实验性SAH模型对大鼠海马细胞凋亡和认知功能障碍保护作用的研究。首先建立成熟、稳定、可重复的大鼠SAH模型（枕大池二次注血模型），分为假手术组、SAH模型二甲基亚砜（dimethylsulfoxide,DMSO）对照组和YC-1抑制组共三组，YC-1为HIF-1的特异性抑制剂，在SAH模型建立的前30min以及后24h的时候，给大鼠腹腔注射2mg/kg的YC-1（溶于DMSO），DMSO对照组注射相同剂量的DMSO，假手术组腹腔未注射药物。然后在48h时，通过免疫组化和Western blot观察HIF-1和它的下游靶分子VEGF、EPO、GLUT1的在各组大鼠海马的表达变化；进一步通过免疫组化观察各组大鼠海马CA1区Caspase-3的形态学表达变化、Westernblot检测海马Caspase-3的蛋白表达和酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）测定海马细胞死亡DNA断片，通过统计分析，以明确各组大鼠海马凋亡情况；最后通过Morris水迷宫（Morris water maze, MWM）测定各组大鼠的逃避时间和路程、目标象限停留时间和距离，统计比较各组大鼠认知功能损伤变化。结果显示在SAH模型建立48h，大鼠海马HIF-1和它的下游分子VEGF、EPO、GLUT1的表达增加（P 0.01），YC-1抑制组这四种分子的表达减少（P0.01）；在SAH模型建立48h，大鼠海马CA1区的Caspase-3阳性细胞增多（P0.01），海马的Caspase-3蛋白表达和细胞死亡的DNA断片增加（P0.01），与DMSO对照组相比，YC-1抑制组大鼠海马CA1区的Caspase-3阳性细胞进一步增多（P 0.01），海马的Caspase-3蛋白表达和细胞死亡的DNA断片进一步增加（P0.01）；在SAH模型建立48h，大鼠在MWM中的逃避时间和路程延长（P 0.01），在目标象限的停留时间和距离增加（P 0.01），与DMSO对照组相比，YC-1抑制组大鼠在MWM中的逃避时间和路程进一步延长（P0.01），在目标象限的停留时间和距离进一步增加（P 0.01）。实验一的研究结果表明在大鼠SAH模型48h，HIF-1及其效应分子VEGF、EPO、GLUT1在海马的表达增加，而抑制它们的表达会恶化海马细胞的凋亡，降低大鼠的认知能力，这提示在SAH早期，HIF-1可能参与了海马细胞凋亡和认知功能损伤的保护。实验二是关于HIF-1在实验性SAH模型对大鼠血脑屏障（blood brain barrier,BBB）的作用研究。首先建立大鼠枕大池二次注血SAH模型，分为假手术组、DMSO对照组和YC-1抑制组共三组，给药方案同实验一；然后在48h时，通过Westernblot观察HIF-1被YC-1抑制后各组大鼠脑Occludin、Claudin-5蛋白的表达变化；进一步通过伊文思蓝（Evans blue）染色观察各组大鼠脑蓝染变化、分光光度计测定各组大鼠脑伊文思蓝含量，通过统计分析，以明确各组大鼠BBB损伤变化情况。结果显示在SAH模型建立48h，BBB损伤的标志物Occludin和Claudin-5蛋白表达增加（P0.01），YC-1抑制组大鼠脑Occludin和Claudin-5蛋白表达与DMSO对照组相比则明显减少（P 0.01）；在SAH模型建立48h，大鼠脑的伊文思蓝染色明显，YC-1抑制组大鼠脑伊文思蓝染色与DMSO对照组相比则明显减淡，伊文思蓝定量分析显示在SAH模型建立48h，大鼠脑的伊文思蓝含量增加（P0.01），YC-1抑制组大鼠脑伊文思蓝含量与DMSO对照组相比则明显减少（P 0.01）。实验二的研究结果表明在大鼠SAH模型48h，HIF-1的表达减少降低了BBB的通透性，减轻了BBB损伤，提示在SAH早期，HIF-1可能参与并恶化了BBB的损伤。实验一和实验二的结果提示HIF-1在SAH早期可能发挥了双向调节作用。实验三是关于槲皮素在实验性SAH模型对大鼠脑氧化应激和脑水肿保护作用的研究。首先建立大鼠枕大池二次注血SAH模型，分为假手术组、SAH模型生理盐水对照组、槲皮素10mg/kg剂量组、槲皮素50mg/kg剂量组共四组，在SAH模型建立后30min、12h及24h的时候，分别给槲皮素10mg/kg剂量组和50mg/kg剂量组大鼠腹腔按体重注射10mg/kg和50mg/kg的槲皮素，生理盐水对照组腹腔注射同等剂量的生理盐水，假手术组腹腔未注射药物。然后在48h时，通过改良的啮齿类动物神经系统功能评分表对各组大鼠进行评分，观察神经功能缺失情况（分数越高，神经功能障碍越重）；然后通过ELISA对各组大鼠脑皮层抗氧化酶铜、锌离子超氧化物歧化酶（CuZn-superoxide dismutase, CuZn-SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase, GSH-Px）的测定，以及反映脂质过氧化的指标丙二醛（malonaldehyde,MDA）的测定，明确槲皮素的抗氧化应激能力；进一步通过免疫组化观察各组大鼠海马CA1区Caspase-3的形态学表达变化、Western blot检测海马Caspase-3的蛋白表达，通过统计分析，以明确各组大鼠海马凋亡情况；最后通过湿/干法测定各组大鼠的脑组织含水量，以明确各组大鼠的脑水肿情况。结果显示在SAH模型建立48h，大鼠神经功能评分增加（P0.01），10mg/kg剂量槲皮素治疗组与生理盐水对照组相比没有显著性差异（P0.05），而50mg/kg剂量槲皮素治疗组大鼠的神经功能评分与生理盐水对照组相比明显降低（P 0.01）；在SAH模型建立48h，大鼠脑皮层CuZn-SOD和GSH-Px活性下降（P 0.01），MDA水平升高（P 0.01），10mg/kg剂量槲皮素治疗组与生理盐水对照组相比没有显著性差异（P0.05），而50mg/kg剂量槲皮素治疗组大鼠的脑皮层CuZn-SOD和GSH-Px活性与生理盐水对照组相比明显升高（P0.01），MDA水平下降（P0.01）；在SAH模型建立48h，大鼠海马CA1区的Caspase-3阳性细胞增多（P 0.01），海马的Caspase-3蛋白表达增加（P 0.01），10mg/kg剂量槲皮素治疗组与生理盐水对照组相比没有显著性差异（P0.05），而50mg/kg剂量槲皮素治疗组大鼠与生理盐水对照组相比，海马CA1区的Caspase-3阳性细胞明显减少（P0.01），海马的Caspase-3蛋白表达明显降低（P0.01）；在SAH模型建立48h，大鼠脑组织水含量增加（P 0.01），10mg/kg剂量槲皮素治疗组与生理盐水对照组相比没有显著性差异（P0.05），而50mg/kg剂量槲皮素治疗组大鼠的脑组织水含量与生理盐水对照组相比明显降低（P0.01）。实验三的结果表明在SAH模型建立48h，50mg/kg剂量的槲皮素可以增强大鼠脑的抗氧化应激酶活性及减轻脂质过氧化程度，可以减轻海马凋亡和脑水肿，并可以减轻大鼠神经功能障碍，但10mg/kg剂量槲皮素没有起到这些作用，提示在SAH早期，合适剂量的槲皮素治疗可以通过抗氧化应激、抑制神经元凋亡和减轻脑水肿等方面起到降低SAH后EBI程度的作用。实验四是关于槲皮素在实验性SAH模型对大鼠脑基底动脉（basilar artery, BA）脑血管痉挛（cerebral vasospasm, CVS）作用的研究。首先建立大鼠枕大池二次注血SAH模型，分为假手术组、SAH模型生理盐水对照组、槲皮素10mg/kg剂量组、槲皮素50mg/kg剂量组共四组，在SAH模型建立前半个月的每天1次，建立后30min、12h及24h的时候，分别给槲皮素10mg/kg剂量组和50mg/kg剂量组大鼠腹腔按体重注射10mg/kg和50mg/kg的槲皮素，生理盐水对照组腹腔注射同等剂量的生理盐水，假手术组腹腔未注射药物；然后在72h时，通过基底动脉切片的HE染色观察各组大鼠BA管腔直径、管壁厚度，并计算各组大鼠BA面积进行比较；进一步通过Western blot检测各组大鼠BA内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）蛋白的表达变化；最后通过ELISA测定各组大鼠血清eNOS的浓度。结果显示在生理盐水对照组，大鼠BA管腔内有血栓组织，血管壁的厚度增加，管腔直径变短，BA面积变小（P 0.01），10mg/kg剂量槲皮素治疗组与生理盐水对照组相比没有显著性差异（P0.05），而50mg/kg剂量槲皮素治疗组与生理盐水对照组相比，血管壁的厚度增加，管腔直径变长，BA面积变大（P0.01）；在SAH模型建立72h，大鼠BA的eNOS蛋白表达减少（P0.01），10mg/kg剂量槲皮素治疗组与生理盐水对照组相比没有显著性差异（P0.05），而50mg/kg剂量槲皮素治疗组大鼠与生理盐水对照组相比，大鼠BA的eNOS蛋白表达明显增加（P 0.01）；在SAH模型建立72h，大鼠血清eNOS浓度降低（P0.01），10mg/kg剂量槲皮素治疗组与生理盐水对照组相比没有显著性差异（P0.05），而50mg/kg剂量槲皮素治疗组大鼠与生理盐水对照组相比，大鼠血清eNOS浓度明显升高（P0.01）；实验四的结果表明在SAH模型建立72h，50mg/kg剂量的槲皮素治疗可以增加大鼠BA中eNOS蛋白的表达和血清eNOS的浓度，可以缓解脑BA痉挛，但10mg/kg剂量槲皮素没有起到这些作用，提示合适剂量的槲皮素治疗可以通过增加BA内eNOS蛋白的表达和提高血清eNOS浓度等方面起到在SAH后早期抗CVS的作用。实验五是关于槲皮素在实验性SAH模型对大鼠海马HIF-1的调节作用研究。首先建立大鼠枕大池二次注血SAH模型，分为假手术组、SAH模型生理盐水对照组和槲皮素组共三组，在SAH模型建立前半个月的每天1次，建立后30min、12h及24h的时候，给槲皮素组大鼠腹腔按体重注射50mg/kg的槲皮素，生理盐水对照组腹腔注射同等剂量的生理盐水，假手术组腹腔未注射药物；然后在48h时，通过免疫组化观察各组大鼠海马CA1区HIF-1的形态学表达变化；进一步通过Western blot检测各组大鼠海马HIF-1的蛋白表达变化。结果显示在SAH模型建立48h，大鼠海马CA1区的HIF-1阳性表达增多（P 0.01），与生理盐水对照组相比，槲皮素组大鼠海马CA1区的HIF-1阳性表达进一步增多（P 0.01）；在SAH模型建立48h，大鼠海马的HIF-1蛋白增多（P 0.01），与生理盐水对照组相比，槲皮素组大鼠海马的HIF-1蛋白进一步增多（P0.01）。实验五的研究结果表明在大鼠SAH模型48h，槲皮素可以上调HIF-1在海马的表达，这提示在SAH早期，槲皮素也可能通过HIF-1这一途径发挥了脑保护作用。本论文首次在大鼠SAH模型早期，观测了HIF-1对海马凋亡、认知功能和BBB功能的影响，并检测了槲皮素对脑氧化应激、脑水肿和CVS的影响，进一步研究了槲皮素对HIF-1的调节作用。结果显示HIF-1在SAH早期可能发挥了双向调节作用，合适剂量的槲皮素可以降低SAH后EBI程度，并且可能通过HIF-1这一途径起到了脑保护作用，但仍需要进一步的体外试验，以及深入研究它们的相互作用机制，以为提高SAH救治成功率提供可能的治疗靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R743.35

【参考文献】