卫星胶质细胞上容量激活氯电流的分子基础及其激活机制研究

发布时间：2018-01-30 22:45

  本文关键词： 卫星胶质细胞 容量激活氯电流 钙离子 TMEM16A 磷脂酶C　出处：《河北医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：作为外周神经节中一种重要的神经胶质细胞，卫星胶质细胞(satelliteglial cells, SGCs)越来越多的受到人们的关注，它不仅可以为神经元提供营养及结构的支持，近来人们还发现它们参与了与神经元之间的信息交流，对神经元的兴奋性产生了影响。因此，卫星胶质细胞对神经元生理和病理状态的影响成为了研究者关注的焦点之一。在神经元与卫星胶质细胞的信息交流中，容量激活的氯通道可能发挥着很重要的作用，因为容量激活氯通道的开放可能影响着神经元和胶质细胞间谷氨酸的释放,进而影响了神经元的兴奋性，这一神经活动与疼痛的发生有着密切的联系。 容量激活的氯电流(volume-acticated chloride currents，Iclswell)属于氯通道电流的一种。氯离子通道是体内最重要的阴离子通道，广泛分布于各种组织，参与机体各种病理和生理过程,包括心率的形成、细胞的增殖和分化、细胞体积的调控以及细胞凋亡等。但是人们对其分子结构、调节机制、信号转导通路的认识还相对较少。对神经系统容量激活氯通道的全面认识有利于我们发现一些疾病包括疼痛的基本病理过程，为进一步的治疗提供可靠靶点。 第一部分卫星胶质细胞上容量激活氯电流的表达及分子基础研究 目的：了解大鼠背跟神经节（DRG）卫星胶质细胞上是否存在容量激活氯电流，及其分子基础。 方法：（1）全细胞膜片钳技术记录大鼠DRG卫星胶质细胞上容量激活氯电流；（2）螯合细胞内钙离子，阻断细胞膜嘌呤受体等方法探明容量激活氯电流的激活机制；（3）慢病毒siRNA特异性敲除卫星胶质细胞上的TMEM16A分子，研究容量激活氯电流与TMEM16A表达的关系。 结果： 1大鼠背根神经节卫星胶质细胞上表达容量激活的氯离子电流。 全细胞膜片钳实验结果表明，高渗电极内液条件下，在holding电压为-60mV下，在大鼠DRG卫星胶质细胞可以观察到一内向电流。100μM鞣酸（Tannic acid，，TA，氯离子通道阻断剂）可以阻断该电流。当将高渗细胞内液CsCl2中的Cl-用SO2-4代替后，高渗内液诱导的内向电流消失。 2卫星胶质细胞上容量激活的氯离子电流的激活与细胞内钙离子的释放有关。 将高渗细胞内液中的低浓度EGTA分别用高浓度的BAPTA和高浓度的EGTA替代时，在膜片钳下记录，当电压holding在-60mV时，随着细胞体积不断增加而出现的内向电流分别下降了96.9%±2.5%(P0.01, n=9)和80.8%±17.2%(P0.01, n=8)。 3容量激活氯离子电流的激活与ATP受体激活有关 在卫星胶质细胞上，待容量激活的氯电流稳定后，给予100μM的苏拉明（suramin，P2受体阻断剂）后电流与给药之前相比下降了34.8%±2.0%(P0.01, n=5)。 4卫星胶质细胞上容量激活的氯电流的分子基础可能是TMEM16A 接下来我们用siRNA慢病毒特异性地敲除卫星胶质细胞上的TMEM16A，再用上述的高渗内液在膜片钳下记录容量激活的氯电流，与对照组相比，转染TMEM16A siRNA的胶质细胞的容量激活的氯电流下降了79.6%±10%(P0.01，n=8)。 结论：通过膜片钳实验，发现大鼠DRG卫星胶质细胞上存在容积激活的氯电流，其激活可能与细胞内钙离子的释放有关。这种容量依赖的氯电流的分子基础可能是TMEM16A。 第二部分背根神经节中磷脂酶C的表达 目的：研究在大鼠背根神经节中磷脂酶C (Phospholipase C, PLC)的表达特征，为进一步研究磷脂酶C是否参与了容量激活氯电流的激活过程奠定基础。 方法：RT-PCR; western blotting;免疫荧光。 结果： 1PCR实验结果 实验结果显示，在大鼠背根神经节中，四种PLC-β亚型的mRNA表达水平，以PLC-β3的表达水平最高，PLC-β4和PLC-β1次之，PLC-β2的基因表达水平最低。 2免疫荧光结果 在大鼠背根神经节中，PLC-β3、PLC-β4均大量的表达于DRG神经元上，且可以与标记中小神经元的IB4共表达，但是并不仅仅表达于中小神经元。另外，PLC-β1、β2在DRG神经元中表达量较少。 3Western blotting实验结果 在大鼠DRG神经节中，PLC-β1、β2、β3、β4蛋白均有表达。 结论：实验初步确定PLC-β3和PLC-β4的表达水平较高，应该作为我们下一步探明容量激活氯电流信号通路的关键磷脂酶C亚型。
[Abstract]:As a kind of important glial cells in peripheral ganglia in satellite glial cells (satelliteglial, cells, SGCs) is attracting more and more attention, it can not only provide nutrients and structural support for neurons, recently found that they participated in the exchange of information between God and element, on neuronal excitability produced the effect of impact. Therefore, satellite glial cells on neuronal physiological and pathological condition has become the focus of attention of researchers. In the information exchange of neurons and satellite glial cells in the activated chloride channel capacity may play a very important role, because the volume activated chloride channel opening may affect neurons and glial cells between the release of glutamate, thereby affecting the excitability of neurons, the neural activity and the occurrence of pain are closely linked.
Volume activated chloride current (volume-acticated chloride, currents, Iclswell) is a kind of chloride channel currents. Chloride channel is the most important in the anion channel, widely distributed in various organizations, participate in various pathological and physiological process of the body, including the heart rate formation, cell proliferation and differentiation, cell volume regulation and apoptosis but people the regulation mechanism of the molecular structure, and understanding of the signal transduction pathway is relatively small. We can find some diseases including the basic pathological process of pain on the comprehensive understanding of the nervous system volume activated chloride channels, provide a reliable target for further treatment.
Part 1 expression of capacity activated chlorine current on glial cells and molecular basis study
Objective: To investigate whether there is a capacity activating chlorine current and its molecular basis on the rat dorsal heel ganglion (DRG) satellite glial cells.
Methods: (1) whole cell patch clamp recording in rat DRG satellite glial cell volume activated chloride current; (2) chelation of intracellular calcium, activation of purinergic receptor blocking cell membrane method and explore the capacity of activated chloride currents; (3) lentiviral siRNA specific knockdown of TMEM16A molecules in satellite glial cells the study of the relationship between the expression of activated chloride current and the capacity of TMEM16A.
Result锛

本文编号：1477436