TrkB受体激动剂对帕金森病动物模型的保护作用及机制研究

发布时间：2018-01-31 17:33

  本文关键词： 帕金森病 神经保护 deoxygedunin MPTP 帕金森病 天冬酰胺内切酶 a-synuclein tau N368 帕金森病 AEP 鱼藤酮 tau N368　出处：《华中科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分TrkB受体激动剂deoxygedunin对MPTP诱导的PD小鼠模型的保护作用及机制研究目的研究小分子酪氨酸受体激酶B (tyrosine receptor kinase B, TrkB)激动剂deoxygedunin对MPTP诱导PD小鼠模型的神经保护作用。方法给予C57/BL6小鼠1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四羟吡啶(MPTP)腹腔注射(每次20mg/kg,2次/天,每次注射间隔2h)建立PD小鼠亚急性损伤模型。将36只8至9周大小的雄性C57/BL6小鼠随机分为三组：正常组、PD组、deoxygedunin干预组(自造模开始deoxygedunin干预2周,5mg/kg/d, i.p.)。采用爬杆实验评估MPTP小鼠的运动功能：酪氨酸羟化酶免疫组化评估deoxygedunin对MPTP小鼠黑质多巴胺能神经元和纹状体神经纤维完整性的保护作用；免疫荧光双标法检测p-TrkB(Y816)与TH阳性神经元的共表达情况;RT-PCR检测中脑黑质BDNF、a-synuclein及TrkB mRNA表达水平；Western blot法检测MPTP小鼠中脑黑质TH、BDNF、 p-TrkB/TrkB、p-MAPK/MAPK、p-Akt(S473)/Akt、caspase-3、Bcl-xl的表达变化。结果MPTP给药后模型组C57/BL6小鼠体重随给药时间逐渐下降,deoxygedunin能够缓解MPTP引起的小鼠体重下降。在MPTP小鼠爬杆实验中,干预组小鼠头转向下时间(T-turn)及下至杆底时间(TLA)均较PD组小鼠明显缩短(P0.05)。TH免疫组化发现经干预组小鼠黑质纹状体酪氨酸羟化酶表达水平较PD模型组显著升高(P0.05),同时中脑黑质磷酸化TrkB的水平较PD模型组和正常对照组显著升高(P0.05)。干预组和PD模型组小鼠黑质BDNF mRNA表达较正常组升高,PD组a-synuclein mRNA表达较正常组和干预组升高,差异均无统计学意义(P0.05); deoxygedunin干预组TrkB mRNA表达水平较PD模型组和对照组显著升高(P0.001)。在MPTP神经毒性小鼠PD模型中,deoxygedunin干预组TH、 p-TrkB/TrkB、p-MAPK/MAPK、p-Akt (S473)/Akt、Bcl-xl蛋白表达均较PD模型组升高,caspase-3表达较对照组降低(P0.05)。结论deoxygedunin能够改善MPTP神经毒性小鼠模型的运动减少,可能通过激活TrkB受体及下游信号通路如PI3k/Akt及MAPK等,抑制凋亡信号通路,发挥多巴胺神经元神经保护作用。第二部分AEP特异性切割产物tau蛋白N368片段和a-synuclein在三种PD动物模型中的表达目的天冬酰胺内切酶(asparagine endopeptidase, AEP)激活并特异性切割tauN368片段是AD病理改变中发现的新现象,黑质纹状体a-synuclein的磷酸化和异常聚集是帕金森病(Parkinson's disease,PD)的主要病理改变,本研究拟在3种经典PD模型中检测AEP特异性切割的tau N 368片段和a-synuclein蛋白在黑质、纹状体、海马等不同脑区是否存在共表达。方法帕金森动物模型制备：(1)慢性MPTP PD小鼠模型：将20只8周龄C57 BL/6雄性小鼠,随机分为对照组和模型组,给予模型组小鼠背部皮下注射MPTP(25mg/kg/次),每周2次,连续5周；对照组经同样注射方式给予同等体积的生理盐水。(2)慢性小鼠鱼藤酮PD模型：将20只C57BL/6雄性小鼠,随机分为对照组和模型组,给予模型组小鼠背部皮下注射rotenone(1 mg/kg/d),连续注射50天;对照组按同样方式给予同等体积的DMSO和生理盐水混合液。(3)鱼藤酮大鼠PD模型：将24只雌性SD大鼠,随机分为对照组和模型组；给予模型组大鼠背部皮下注射rotenone (1.5mg/kg/day),连续注射5周：对照组按同样方式给予同等体积的溶媒(DMSO和玉米油混合液)背部皮下注射。酪氨酸羟化酶免疫组化和荧光法评估不同PD模型黑质多巴胺能神经元的损伤情况;免疫荧光双标法检测三种PD模型海马、皮质、纹状体和黑质a-synuclein和tau N368共表达情况。采用免疫组织化学和Western blot方法检测各组动物中脑黑质、纹状体、海马磷酸化a-synuclein和tau N368表达水平。结果三种PD动物模型中脑黑质致密部TH阳性神经元数目明显减少,提示PD模型造模成功。免疫荧光双标法检测发现鱼藤酮诱导的PD小鼠模型中脑黑质部位a-synuclein和tau N368存在共表达现象,且表达水平较对照组显著增加,而在海马和皮层中未发现显著的共表达现象：鱼藤酮PD小鼠模型海马CA1区a-synuclein和tau N368表达与正常组相比未见明显变化,而皮层tau N368表达较对照组明显增多。MPTP诱导的小鼠PD模型黑质和海马CA1区tau N368表达增多,而在相同解剖部位的a-synuclein表达未见明显变化;皮层的a-synuclein和tau N368表达组间均未见显著变化。免疫组化提示鱼藤酮诱导的PD大鼠模型纹状体a-synuclein和tau N368表达均较对照组明显增多,中脑黑质磷酸化a-synuclein表达增多,同时黑质和海马tauN368表达组间未见显著性差异。在模型组Western blot检测同时发现三种PD动物模型纹状体磷酸化a-synuclein (Ser129)和tau N368表达水平均较对照组增加,而在黑质和海马中表达存在不一致性：MPTP诱导的PD小鼠模型黑质和海马tau N368表达较对照组升高,而p-a-synuclein(S129)表达无明显变化：鱼藤酮诱导PD小鼠模型海马p-a-synuclein(S129)和tau N368表达与对照组相比均未见明显变化；鱼藤酮诱导的PD大鼠模型海马p-a-synuclein(S129)表达较对照组增加,而tau N368的表达无明显变化。结论PD动物模型的中脑黑质和纹状体存在AEP激活后特异性切割tau蛋白现象,所特异性切割的tau蛋白片段N368和a-synuclein在纹状体或黑质存在共表达,提示AEP及其特异性切割作用可能参与了帕金森的发病过程。第三部分7,8-DHF通过调节AEP表达及其切割效应对鱼藤酮诱导的PD大鼠模型的保护作用研究目的研究酪氨酸受体激酶B (tyrosine receptor kinase B, TrkB)激动剂7,8-DHF对鱼藤酮诱导的PD大鼠模型的保护作用及作用机制。方法将36只9月龄的SD大鼠随机分为三组：分布为照组(10只),模型组(13只),7,8-DHF干预组(13只)。给予PD模型组和干预组大鼠背部皮下注射鱼藤酮(2mg/kg/day),连续注射5周：对照组按同样方式给予同等体积的溶媒(如DMSO和玉米油混合液)背部皮下注射；自造模开始给予干预组大鼠7,8-DHF干预5周,5mg/kg/day, i.p.).采用旷场实验评估PD大鼠的行为学：酪氨酸羟化酶TH免疫组织化学及免疫荧光评估大鼠黑质多巴胺能神经元和纹状体神经纤维的完整性；免疫组化检测黑质p-TrkB (Y816)表达水平;Western blot法检测各组大鼠中脑黑质和纹状体TH、BDNF、p-TrkB/TrkB、p-MAPK/MAPK、p-Akt (S473)/Akt、AEP、 p-tau(S396)、p-a synuclein (S129)、a-synuclein和tau N368的表达变化。结果鱼藤酮造模后,旷场实验组中模型组大鼠运动距离较正常组明显减少,给予7,8-DHF干预可改善鱼藤酮诱导的PD模型运动障碍。TH免疫荧光发现干预组大鼠黑质TH阳性细胞数较模型明显增多(P0.05),纹状体TH免疫组织化学提示7,8-DHF能够保护PD模型纹状体多巴胺能神经纤维的完整性。模型组大鼠黑质和纹状体的p-a-synuclein (Ser129)、p-tau(S396)、AEP表达及特异性切割产物tau N368表达均较正常组和干预组升高(P0.05)。与模型组相比较,干预组黑质p-TrkB/TrkB及p-Akt/Akt水平显著升高,p-MAPK/MAPK水平下降,纹状体及黑质AEP、 p-a-synuclein (Ser 129)、a-synuclein、p-tau(S396)及tau N368的表达减少(P0.05)。结论7,8-DHF能够改善鱼藤酮诱导PD模型大鼠的运动障碍,可能通过激活TrkB受体及下游信号通路Akt,降低MAPK、a-synuclein和tau的异常磷酸化水平,抑制AEP表达及其特异性切割作用,发挥神经保护作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.5;R-332

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本文编号：1479612