自噬在羊布鲁杆菌Omp31诱导小胶质细胞炎症中的可能机制
发布时间：2018-02-11 15:30
本文关键词： 羊布鲁杆菌 Omp31 小胶质细胞 自噬 炎症 NF-κB(P65) 出处：《宁夏医科大学》2017年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：1.目的本研究:⑴用不同浓度Omp31处理BV-2细胞6h(文献报道诱导自噬的时间),一是明确Omp31能否诱导BV-2细胞自噬,二是确定Omp31诱导自噬的合适浓度。⑵用合适浓度的Omp31处理BV-2细胞不同时间,目的是验证BV-2细胞发生自噬的时间是否和文献报道时间吻合,以便进一步研究自噬在BV-2细胞炎症中的机制。⑶用不同浓度的Rapa和3-MA处理BV-2细胞24h,以确定Rapa诱导自噬的浓度及3-MA抑制自噬的浓度。⑷用Omp31、Rapa及3-MA处理BV-2细胞,以确定自噬能否通过调控NF-κB(P65)通路影响TNF-α的表达。2.方法⑴羊布鲁杆菌Omp31诱导BV-2小胶质细胞自噬①(0、0.17、0.5、1.5、4.5、13.5)μg/m L Omp31处理BV-2细胞6h,用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3B的表达;RT-q PCR检测LC3B m RNA的相对表达水平;透射电镜观察BV-2细胞内的自噬体;ELISA法检测TNF-α、IL-6及IL-10的表达;②0.5μg/m L Omp31处理BV-2细胞(0、6、12、24)h,用Western blot检测自噬相关蛋白LC3B的含量;RT-q PCR检测LC3B m RNA的相对表达水平;透射电镜观察BV-2细胞内的自噬体;ELISA法检测TNF-α、IL-6及IL-10的表达。⑵Omp31诱导的自噬对BV-2细胞NF-κB(P65)通路的作用①(2.5、5、10)μM Rapa、(2.5、5、10)m M 3-MA预处理BV-2细胞24h,用We stern blot检测自噬标志物LC3BⅡ蛋白的含量;②Omp31、Rapa及3-MA处理BV-2细胞6h,用Western blot检测自噬相关蛋白B eclin-1、LC3B、P62以及NF-κB(P65)通路相关蛋白IκBα、p-P65、t-P65的表达;ELIS A法检测TNF-α的表达;RT-q PCR检测(Beclin-1、LC3B、TNF-α)m RNA的相对表达;透射电镜观察细胞内自噬体;免疫荧光技术检测p-P65蛋白入核。3.结果⑴不同浓度Omp31处理BV-2细胞6h,发现0.5μg/m LOmp31能使LC3B蛋白及m RNA的表达量增加,与其余各组相比差异有统计学意义(P0.05),且能使LC3BⅡ蛋白含量增加(P0.05),同时在透射电镜下可见较多自噬体;⑵各浓度组TNF-α、IL-6表达量均较对照组增加(P0.05),0.5μg/m L实验组TNF-α、IL-6表达量较其他实验组低(P0.01)。各实验组IL-10表达量较对照组均降低(P0.05),且不具有浓度依赖性;⑶0.5μg/m LOmp31处理BV-2细胞不同时间,结果显示,各实验组LC3B蛋白的表达及LC3BⅡ蛋白含量较对照组增加(P0.05),6h组LC3BⅡ蛋白含量及LC3Bm RNA表达量较其余各组增加(P0.01),并且在透射电镜下可见较多自噬体;⑷各时间组TNF-α、IL-6表达量均较对照组增加(P0.01),且具有时间依赖性,而IL-10表达量均较对照组减少(P0.01),与时间无关;⑸5μM Rapa预处理BV-2细胞后LC3BⅡ蛋白含量较各组均增加(P0.01),2.5m M3-MA预处理BV-2细胞能降低LC3BⅡ蛋白含量,与其余各组相比差异有统计学意义(P0.01);⑹Omp31、Rapa和3-MA处理BV-2细胞,结果显示:Omp31和Rapa均能促进L C3B及Beclin-1蛋白表达,亦能促进二者m RNA的表达,且均能增加LC3BⅡ蛋白含量,以上结果与对照组结果相比差异均有统计学意义(P0.05)。3-MA对LC3B蛋白和m RN A的表达以及Beclin-1蛋白的表达无影响,但较对照组能降低LC3BⅡ蛋白含量,并且抑制Beclin-1 m RNA的表达(P0.05)。Omp31和Rapa都能降低P62蛋白含量,而3-M A则导致P62蛋白含量增加,与对照组相比均有统计学差异(P0.05)。在透射电镜下可见Omp31和Rapa均能诱导自噬体形成,而3-MA对自噬体形成有抑制作用。⑺Omp31、Rapa及3-MA均能使IκBα和t-P65蛋白含量降低,与对照组相比差异有统计学意义(P0.01)。Omp31能增加p-P65蛋白水平,而Rapa和3-MA都能使p-P65蛋白水平降低,与对照组相比均有统计学差异(P0.05)。用免疫荧光技术检测p-P65蛋白入核,可知Omp31能增加胞核内p-P65蛋白的含量,而Rapa及3-MA使胞核内p-P65蛋白含量减少;⑻Omp31与对照组相比能增加TNF-α表达量(P0.01),而Rapa及3-MA则使TN F-α表达量降低(P0.01)。与对照组相比,Omp31、Rapa和3-MA均能使TNF-αm RNA表达量降低(P0.01)。4.结论⑴羊布鲁杆菌Omp31能诱导BV-2细胞自噬,并促进TNF-α、IL-6表达,抑制IL-10表达;⑵自噬能负性调控NF-κB(P65)信号通路,进而抑制TNF-α的表达。
[Abstract]:The purpose of this study is as follows: 1. BV-2 cells were treated with different concentrations of Omp31 6h (reported to induce autophagy time) is clear, a Omp31 can induce autophagy in BV-2 cells, the two is to determine the appropriate concentration of Omp31 induced autophagy. 2 with appropriate concentration of Omp31 treated BV-2 cells at different time, to verify whether the autophagy of BV-2 cells time and time are reported in the literature, in order to further study the mechanism of autophagy in BV-2 cells inflammation. 3 with different concentrations of Rapa and 3-MA in BV-2 cells treated with 24h, to determine the concentration of 3-MA and Rapa induced autophagy inhibition of autophagy. The concentration of Omp31, Rapa and 3-MA treated BV-2 cells, to determine whether the regulation of autophagy the expression of NF- B (P65) pathway on expression of.2. TNF- alpha 1 methods of Brucella melitensis Omp31 induced autophagy in BV-2 microglia 1 (0,0.17,0.5,1.5,4.5,13.5) g/m L Omp31 6h in BV-2 cells treated with Western blot method. To detect the expression of autophagy related protein LC3B; LC3B m RNA RT-q to detect the relative expression level of PCR; TEM observation of autophagosomes in BV-2 cells; detection of TNF- alpha ELISA method, the expression of IL-6 and IL-10; the 0.5 g/m L Omp31 BV-2 (0,6,12,24) H cells, determination of autophagy related protein LC3B by Western blot check the relative expression of LC3B m RNA; RT-q PCR; transmission electron microscope was used to observe autophagy in BV-2 cells; detection of TNF- alpha ELISA method, the expression of IL-6 and IL-10. The Omp31 induced autophagy of BV-2 cells NF- kappa B (P65) function pathway (2.5,5,10) M (Rapa, 2.5,5,10) pretreatment of BV-2 cells with 24h m M 3-MA, marking content of LC3B II protein by We stern blot of Omp31 Rapa, detection of autophagy; 3-MA and BV-2 cells treated with Western blot 6h, detection of autophagy related protein B eclin-1, LC3B, P62 and NF- K B (P65) pathway related protein I kappa B alpha, p-P65. The expression of t-P65; ELIS A娉曟娴婽NF-伪鐨勮〃杈，
本文编号：1503388
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