FK506抑制钙神经素改善学习记忆和减轻脑水肿及星形胶质细胞增生的研究

发布时间：2018-02-11 16:45

本文关键词： 颞叶癫痫癫痫持续状态认知损害海马 FK506 癫痫持续状态脑水肿钙神经素胶质纤维酸性蛋白胶质增生 FK506　出处：《山东大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：癫痫是神经科常见病,发病率高,根据目前的流行病学资料,我国的癫痫患者大约在900多万左右,大约25%-30%的患者发展为难治性癫痫。严重威胁患者本人健康,生活质量明显下降,同时存在较高的致残与致死率。癫痫持续状态(status epilepticus, SE)为神经内科常见急症,表现为患者癫痫发作时持续时间超过5分钟,或者患者反复频繁癫痫发作,意识没有完全恢复。氯化锂一匹鲁卡品癫痫模型作为经典的颞叶癫痫动物模型,该模型的行为学及脑电图改变,与人类癫痫持续状态和颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy, TLE)相似,是目前研究SE和复杂部分性发作最常用的模型之一。研究证实,癫痫持续状态可导致一系列病理生理变化,可导致脑组织神经化学改变,如局灶性脑水肿,星形胶质细胞活化与神经元凋亡坏死等。在其一系列病理生理改变中,钙离子及钙依赖性信号传导途径发挥着重要作用,其中又以神经素(calcineurin, CaN)的作用尤为重要。癫痫发作可引起钙离子在胞内的浓度显著升高,释放明显增加,从而可导致胞内钙神经素的激活,引起神经元内一系列病理改变,导致线粒体功能变化,能量代谢障碍,导致后续级联反应,不仅可导致学习记忆等认知功能障碍,同时会导致海马的病理改变,最终导致癫痫反复发作,难治性癫痫形成。钙神经素是目前为止发现的丝／苏氨酸蛋白激酶家族中唯一受Ca2+/钙调素(CaM)调节的磷酸酶,在神经系统分布丰富。目前研究发现,钙神经素通过其脱磷酸作用,对神经细胞的多种病理生理变化发挥调节作用,如调节生物的学习与记忆,对长时程记忆发挥作用,影响神经递质的释放,在神经元凋亡过程中发挥重要作用。癫痫动物模型相关研究发现,在癫痫的发病发展过程中,可观察到钙神经素的激活,参与了N-甲基-D-天门冬氨基酸(NMDA)受体活化的过程,同时还可调节r-氨酸丁酸(GABA)受体介导的抑制性作用,参与基因转录的调节,细胞骨架蛋白合成等一系列过程,同时可通过与钙蛋白酶、bcl-2相关死亡蛋白、caspase信号途径相关蛋白等许多凋亡分子之间发生作用,介导一系列病理生理过程。还可通过与一氧化氮合酶(NOS)之间的作用参与神经元氧化应激过程。在星形胶质细胞中,钙神经素含量同样丰富,同时,在脑外伤,神经细胞老化及淀粉样变性等多个病理过程中,星形胶质细胞中钙神经素的含量明显升高。FK506因为具有强大的免疫抑制作用,目前在器官移植后被广泛应用于抑制排斥反应。FK506可与FK506结合蛋白12(FKBP 12)结合,通过抑制钙神经素的活性和表达,对一系列生化反应产生影响。同时,不断的动物实验提示,FK506可对神经发挥保护作用。通过大鼠脑缺血模型的研究,FK506可以使脑梗死面积缩小,抑制神经元的凋亡,减轻神经功能损害。在大鼠癫痫模型中,FK506可减轻癫痫发作程度,缩短病程,通过抑制海马区神经元苔藓纤维发芽,减轻癫痫后的海马组织神经元损伤,降低癫痫大鼠死亡率,发挥抗癫痫及神经保护作用。虽然目前关于FK506脑保护方面的实验证据不断出现,但是其具体机制仍未阐明,尚需进一步深入研究。免疫抑制剂雷帕霉素,是一种FK506的衍生物,也可与FKBP 12结合,但是FKBP 12-雷帕霉素结合后的复合物不具备抑制钙神经素活性的生物学作用,这点与FK506不同。本研究通过建立氯化锂一匹鲁卡品癫痫持续状态模型,观察实验动物行为学和学习记忆能力,同时对局灶性脑组织水肿进行相关检测,检测钙神经素及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,同时观察FK506的影响,进一步研究钙神经素在癫痫后学习记忆障碍、局部脑水肿及星形胶质细胞活化增生中的作用,并探讨其可能机制。为癫痫发病机制的进一步研究和临床治疗提供新的思路。本研究分为两个部分：第一部分：氯化锂一匹鲁卡品癫痫大鼠模型的建立、病理观察及FK506对癫痫大鼠行为学、学习记忆能力的作用目的：本研究建立氯化锂一匹鲁卡品癫痫持续状态模型,观察大鼠行为学变化,并对大鼠海马神经元进行进一步的病理学观察。同时观察FK506对癫痫持续状态大鼠的行为学和学习记忆能力的影响,探讨FK506在癫痫大鼠模型中的具体作用机制。方法：1.腹腔注射氯化锂-匹鲁卡品,建立大鼠氯化锂-匹鲁卡品癫痫持续状态模型。随机将实验动物分为三组,分别为正常对照组,癫痫组(pilo组),FK506组。2.根据Racine分级,分别记录大鼠癫痫发作的程度分级,发作潜伏期,癫痫发作起止时间。3.应用Morris水迷宫试验,观察致痫大鼠学习及记忆能力的变化,并观察FK506对大鼠认知功能的影响。4.光镜HE染色观察实验动物癫痫发作后12d海马神经元的变化,包括形态及数目的改变,同时观察FK506对其的影响。结果：1.癫痫组和Fk506组大鼠腹腔注射匹鲁卡品后出现癫痫发作,开始较轻,发作程度逐渐加重,后出现癫痫持续状态。记录各组的潜伏期和发作强度的变化。与癫痫组相比,Fk506组大鼠的潜伏期延长,发作的强度级别降低。对照组大鼠腹腔注射生理盐水后未观察到癫痫发作。2.通过水迷宫试验我们发现,癫痫组潜伏期较对照组明显延长,于目标象限内的游泳距离缩短,次数减少,提示其存在明显认知功能障碍。K506组大鼠在水迷宫中的潜伏期较癫痫组缩短,可见于目标象限内的游泳距离延长,于目标象限内的游泳时间增加,穿过原平台位置的次数增多。提示FK506能改善癫痫持续状态大鼠的学习和记忆能力。3.光镜下对照组大鼠海马未见损害性改变,HE染色示CA3区锥体神经元排列紧密、整齐,分布呈现带状,可见清晰完整的细胞结构,胞浆透明,可见圆形或椭圆形的细胞核,细胞核染色质分布均匀,核仁清晰,形态正常。SE后12d时癫痫组大鼠的海马神经元出现不同程度变性、死亡,排列紊乱,数目减少,部分神经元形态不完整,胞体肿胀、变形、破裂,轮廓模糊、界限不清,坏死的神经元胞浆皱缩,红染,核碎裂甚至消失,失去正常结构,伴有胶质细胞增生；与对照组相比,FK506组神经元也有丢失,数目减少,但与癫痫组比较,存活神经元明显增多,海马损伤明显减轻。结论：1.氯化锂—匹鲁卡品可成功诱导Wistar大鼠癫痫持续状态发作,同时操作简单,造模成功率高,可作为癫痫发病机制的理想模型,可为新型抗癫痫药物提供理论依据。2.癫痫组和Fk506组大鼠腹腔注射匹鲁卡品后出现癫痫持续状态。Fk506组大鼠的潜伏期延长,发作的强度级别降低。提示FK506的抗癫痫作用。3.匹鲁卡品诱导的癫痫持续状态动物模型,其学习和空间记忆能力受损。应用FK506后可使大鼠的学习记忆能力出现好转,提示FK506对大鼠记忆学习能力的保护作用。4.氯化锂—匹鲁卡品癫痫持续状态大鼠海马病理学观察可见神经元损伤性改变,神经元数量减少、细胞结构损伤模糊及核固缩等改变,FK 506组大鼠海马损伤明显减轻。提示FK506的神经保护作用。第二部分：FK506抑制钙神经素减轻癫痫持续状态小鼠脑水肿及星形胶质细胞增生的研究目的：本研究建立氯化锂一匹鲁卡品癫痫持续状态模型,观察行为学变化,核磁共振对局灶性脑组织扫描观察脑水肿变化,测定脑组织水含量,测定钙神经素及GFAP的表达,同时观察免疫抑制剂FK506对脑组织水肿及钙神经素,GFAP表达的影响,进一步研究钙神经素在癫痫后局部脑水肿及星形胶质细胞活化增生中的作用,并探讨其可能机制。方法：1.腹腔注射氯化锂-匹鲁卡品建立小鼠癫痫持续状态模型。随即将实验动物分为四组,为正常对照组,癫痫组,雷帕霉素组,FK506组。2.根据Racine分级,分别记录小鼠癫痫发作的程度分级,发作潜伏期,癫痫发作起止时间。3.应用核磁共振技术对小鼠脑组织扫描,观察癫痫持续状态发作后不同时间点局部脑组织水肿情况。4.应用湿—干重法,检测癫痫持续状态发作后脑组织的水含量。5.通过免疫组织化学染色,观察癫痫持续状态发作后小鼠海马神经元GFAP的表达,进而反应星形胶质细胞的活化增生。6.应用Western Blot方法,测定癫痫持续状态发作后小鼠海马组织钙神经素(CaN)的表达变化。结果：1.癫痫组、Fk506组小鼠腹腔注射匹鲁卡品后出现癫痫发作,开始较轻,发作程度逐渐加重,后出现癫痫持续状态。记录各组的潜伏期和发作强度的变化。与癫痫组相比,Fk506组小鼠的潜伏期、发作的强度级别无明显差异。对照组小鼠腹腔注射生理盐水后未观察到癫痫发作。2.通过对各组小鼠在癫痫发作后的不同时间点行核磁共振检查,结果显示癫痫持续状态后24h可见局部脑组织T2像高信号,提示局部脑组织水肿明显,癫痫持续状态后7d时局部脑组织T2像信号明显减低,提示脑水肿明显减轻。FK506可显著减轻24h时局部的脑水肿,雷帕霉素未见明显的抑制作用。3.脑组织的水含量测定显示癫痫组,FK506组及雷帕霉素组小鼠的脑组织含水量在癫痫发作后24h时明显升高,7d时各组小鼠的脑组织含水量恢复到正常水平。与癫痫组小鼠相比,FK506组小鼠在24h时的脑组织含水量降低,而雷帕霉素组小鼠未显示出明显差异。4.通过Western blot测定癫痫持续状态后24h,72h及7d时脑组织钙神经素的表达。结果提示,钙神经素在癫痫发作后24h显著增加,一直持续到7d。结果提示脑组织的水肿与钙神经素的表达有关。5.通过免疫组化方法检测GFAP的表达。星形胶质细胞胞体的GFAP是一种细胞骨架蛋白,可反映星形胶质细胞活化的状态,是其特征性的蛋白标志,同时可以特异性的对星形胶质细胞进行标记。结果表明,在癫痫发作后72h时GFAP表达增加,7d时更加明显。CaN抑制剂FK506可以抑制GFAP的表达,抑制星形胶质细胞增生。雷帕霉素组在癫痫后7d时GFAP表达比癫痫组低,但比FK506组高,雷帕霉素对GFAP的抑制作用要弱于FK506。结果表明钙神经素在癫痫后星形胶质细胞活化中的作用,FK506可通过抑制钙神经素的表达,发挥抑制星形胶质细胞增生的作用。结论：1.通过核磁共振扫描及脑组织含水量检测,癫痫持续状态后脑组织出现明显脑水肿,发作后7d时水肿明显减轻。FK506可减轻癫痫后脑组织的水肿,发挥脑保护作用,雷帕霉素未见明显的保护作用。2.癫痫持续状态发作后脑组织钙神经素的表达在24h显著增加,一直持续到7d。CaN抑制剂FK506可显著减轻24h时局部的脑水肿,雷帕霉素未见明显的抑制作用。提示脑组织的水肿与钙神经素的表达有关。FK506对脑组织水肿的抑制作用与其抑制钙神经素的表达相关。3.癫痫发作后GFAP的表达增加,反映出星形胶质细胞的活化增生,CaN抑制剂FK506可以抑制GFAP的表达,抑制星形胶质细胞增生。雷帕霉素对GFAP的抑制作用要弱于FK506。提示钙神经素在癫痫后星形胶质细胞活化中的作用,K506可通过抑制钙神经素的表达,发挥抑制星形胶质细胞增生的作用。本课题应用氯化锂—匹鲁卡品癫痫持续状态模型,研究动物行为学,通过水迷宫实验研究实验动物的学习和空间记忆能力,通过7.0T核磁共振对实验动物脑部扫描观察局部脑组织水肿情况,Westblot方法观察CaN在癫痫发作后表达的动态改变,免疫组化观察GFAP的表达,同时观察癫痫发作后海马神经元的损伤。结果提示：钙神经素抑制剂FK506减轻癫痫发作,改善学习和记忆能力,减轻海马神经元的损伤；核磁共振检查示癫痫组局部脑组织T2像高信号,提示局部脑组织水肿明显,钙神经素在癫痫发作后显著增加,钙神经素抑制剂FK506可显著减轻局部的脑水肿,雷帕霉素未见明显的抑制作用,提示脑组织的水肿与钙神经素的表达有关,FK506通过抑制钙神经素的表达,减轻脑组织水肿；钙神经素抑制剂FK506可以抑制GFAP的表达,抑制星形胶质细胞增生,雷帕霉素对GFAP的抑制作用要弱于FK506,表明钙神经素在癫痫后星形胶质细胞活化中的作用,K506可通过抑制钙神经素的表达,发挥抑制星形胶质细胞增生的作用。本实验研究提示钙神经素在癫痫后的认知障碍、脑组织水肿及星形胶质细胞增生中的重要作用,FK506可通过对钙神经素的抑制作用,发挥抗癫痫及脑保护作用,为癫痫发病机制的进一步研究和临床治疗提供新的思路。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.1

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