RNA干扰沉默Lingo-1基因对自身免疫性脑脊髓炎髓鞘修复的影响

发布时间：2018-02-19 21:54

  本文关键词： 少突胶质细胞 RNA干扰 慢病毒载体 Lingo-1基因 少突胶质细胞 髓鞘碱性蛋白 慢病毒载体 自身免疫性脑脊髓炎 基因沉默 髓鞘形成　出处：《华中科技大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景 多发性硬化(MS)是中枢神经系统脱髓鞘性疾病,是青年人常见致残的神经系统疾病之一。髓鞘再生失败和轴突损害是MS患者遗留永久神经功能损害的病理基础,其中反复的髓鞘脱失可以导致轴突损伤。故尽快修复髓鞘,是防止轴突损害和减少残疾发生的关键。赖氨酸重复序列和免疫球蛋白结构域(Leucine rich repeat and Ig domain containing1, Lingo-1)是中枢神经系统成髓鞘细胞(少突胶质细胞)分化成熟的负性调控因子。EAE是目前公认的广泛应用于研究的多发性硬化动物模型。 本研究通过RNA干扰抑制Lingo-1表达,观察Lingo-1抑制对少突胶质细胞和EAE的影响并探讨其机制,为下一步多发性硬化Lingo-1阻断治疗做一些有益的尝试。本研究分三部分。 第一部分Lingo-1shRNA慢病毒载体的构建及筛选 目的：筛选出对小鼠少突胶质细胞Lingo-1表达沉默效率较高的Lingo-1shRNA慢病毒载体。 方法： 1.体外原代培养少突胶质细胞,取材自新生48h内小鼠大脑皮质；应用不同分离纯化方法后测定细胞存活率和纯度,摸索较为理想的细胞获取方法；并进行Lingo-1、MBP免疫荧光鉴定。 2.将编码Lingo-1shRNA慢病毒载体转导少突胶质细胞后,对转导后的细胞行MTT细胞增殖实验,观察转导对细胞生存的影响。 3.转导后96h应用RT-qPCR方法检测了Lingo-1mRNA水平的变化；应用Western blot方法检测Lingo-1蛋白质水平的变化；应用免疫细胞荧光,观察转导后少突胶质细胞上Lingo-1的表达并计数细胞Lingo-1阳性率；筛选出抑制效果最佳的Lingo-1shRNA慢病毒载体。 结果： 1.原代培养的小鼠少突胶质细胞经轻度胰酶消化+短时间振荡法和振荡分离法两种不同分离纯化方法细胞纯度相近(P0.05),但轻度胰酶消化+短时间振荡法细胞存活率更高(96.46+2.26%vs80.25+1.55%,P0.05)。培养细胞经Lingo-1、MBP免疫细胞荧光染色鉴定为阳性。 2.MTT实验显示Lingo-1shRNA慢病毒转导少突胶质细胞后,干扰组与正常组少突胶质细胞OD值间没有显著差异(P0.05)。 3.少突胶质细胞转导Lingo-1shRNA慢病毒96h后,LV/Lingo-1shRNA(1)组和LV/Lingo-1shRNA(2)组Lingo-1mRNA的沉默效率分别为36%和37%,明显高于其它组(P0.05, P0.05); LV/Lingo-1shRNA(1)组和LV/Lingo-1shRNA(2)组Lingo-1蛋白的沉默效率分别为27.6%和28.3%,明显高于其它组(P0.05,P0.05)；免疫细胞荧光染色也显示LV/Lingo-1shRNA(1)和LV/Lingo-1shRNA(2)组Lingo-1蛋白含量明显减少。 结论： LV/Lingo-1shRNA(1)和LV/Lingo-1shRNA(2)为较高沉默效率的慢病毒载体,且对细胞生存率无明显影响。LV/Lingo-1shRNA(2)用于后续的RNA干扰研究。 第二部分Lingo-1shRNA慢病毒载体对少突胶质细胞的影响 目的：探讨Lingo-1shRNA慢病毒载体对小鼠少突胶质细胞的影响。 方法： 1.应用抑制效果最佳的LV/Lingo-1shRNA (2)转导少突胶质细胞,应用RT-qPCR、 Western blot方法检测转导后第1、3、7、14天Lingo-1mRNA和蛋白的表达,并和空白对照组、阴性对照组比较,观察LV/Lingo-1shRNA(2)在不同时间的沉默效率。 2.应用Western blot方法检测转导后第1、3、5、7天少突胶质细胞MBP蛋白表达；应用细胞免疫荧光,计数转导后不同时间少突胶质细胞MBP阳性率,了解Lingo-1shRNA慢病毒载体对少突胶质细胞分化成熟过程的影响。 3.应用Western blot方法检测p-RhoA蛋白质水平的变化,探讨Lingo-1shRNA的可能作用通路。 结果： 1.少突胶质细胞转导LV/Lingo-1shRNA(2)后第3、7、14天,干扰组的Lingo-1mRNA的沉默效率为13.2%、45.1%和57.0%,显著高于对照组(P0.05,P0.05,P0.05)；第3、7、14天,干扰组的Lingo-1蛋白的沉默效率为27%、47%和53%,显著高于对照组(P0.05,P0.01,P0.01)。 2. LV/Lingo-1shRNA (2)干扰后第1天、第7天少突胶质细胞MBP蛋白与对照组相比无显著差异,第3天和第5天MBP蛋白的表达显著增加(2.29±0.13vs1.23±0.08)(2.64±0.21vs1.31±0.11)(P0.01, P0.01)。LV/Lingo-lshRNA(2)干扰后第1天干扰组MBP阳性率为(45.4±5.5)%,与空白对照组无明显差异(P0.05)。第3、5天干扰组MBP阳性率分别为(89.7±7.9)%和(99.6±4.6)%,明显高于对照组(P0.01,P(0.05)。 3. LV/Lingo-1shRNA(2)干扰后24h、48h、72h、96h,干扰组和空白对照组之间p-RhoA蛋白的表达差异无统计学意义(P0.05)。 结论：LV/Lingo-1shRNA对少突胶质细胞中Lingo-1的沉默效率在一定时间内呈逐渐增强趋势。沉默Lingo-1促体外培养的少突胶质细胞更早更快成熟。 第三部分沉默Lingo-1基因表达对自身免疫性脑脊髓炎的影响 目的：探讨沉默LINGO-1表达对EAE小鼠运动功能和髓鞘恢复的影响。 方法： 1.建立EAE小鼠模型,通过RT-PCR、Western-Blot方法,检测了造模成功后第1、3、7、14、21、30天脑组织内Lingo-1的变化,并和正常小鼠比较。 2.造模成功评分在2-3分之间的EAE小鼠,随机分为5组：侧脑室注入5ul滴度为5×109Tu/ml LV/Lingo-1-shRNA(2)组,侧脑室注入5ul滴度为5×108Tu/ml LV/Lingo-1-shRNA(2)组,侧脑室注入5ul滴度为5×107Tu/ml LV/Lingo-1-shRNA (2)组,侧脑室注入5ulLVCON053组和未治疗组；通过RT-PCR、Western-Blot方法,检测转导后不同时间各组脑组织内Lingo-1的变化。 3.对不同组的EAE小鼠进行运动功能评分及髓鞘快蓝染色,探讨侧脑室注入Lingo-1shRNA慢病毒载体对EAE小鼠运动功能恢复及髓鞘形成的作用。 结果： 1.小鼠多在诱导后7-10天左右发病,总发病率为81.3%,平均临床评分为2.45±0.94分。EAE模型组小鼠造模成功第1、3、7、14、21天LINGO-1mRNA和蛋自表达较对照组和佐剂组有明显上调,LINGO-1蛋白表达在第7天上调最为明显(P0.01),其后逐渐下降,至第30天时仍略高于对照组。EAE小鼠LINGO-1mRNA的峰值则出现在第1天,第30天其值接近对照组(P0.05)。 2.在LV/Lingo-1-shRNA注入后第3天开始,5×107、5×108和5×109TU/mlLV/Lingo-1-shRNA组Lingo-lmRNA表达明显降低(2.45±0.15,2.06±0.18,2.14±0.08vs2.80±0.10,P0.05)；在第14天5×108和5×109TU/mlLV/Lingo-1-shRNA组Lingo-1mRNA已降至接近于正常水平(1.19±0.11,1.46±0.10vs1.03±0.09, P0.05,P0.05)。5×107TU/mlLV/Lingo-1-shRNA组在第30天Lingo-1mRNA表达也接近于正常值(1.25±0.06vs1.03±0.12,P0.05)。在Lingo-1蛋白表达方面,5×107、5×108和5×109LV/Lingo-1-shRNA组EAE小鼠从第7天开始均有明显下调(2.53±0.10,1.99±0.13,2.08±0,10vs3.14±0.06, P0.05, P0.01, P0.01),第21天5×108和5×109LV/Lingo-1-shRNA组Lingo-1蛋白已降至接近正常水平(1.14±0.10,1.15±0.03vs1.01±0.03,P0.05,P0.05)。 3.侧脑室注射LV/Lingo-1shRNA (2)后,相比较于LVCON053组和未治疗组,5×107TU/mlLV/Lingo-1-shRNA、5×108TU/mlLV/Lingo-1-shRNA和5×109TU/mlLV/Lingo-1-shRNA三组从第7天开始运动功能评分有不同程度的下降(3.11±0.13,2.42±0.13,2.96±0.10vs3.56±0.15,3.87±0.12,P0.01,P0.01, P0.05)。其中,5×108TU/mlLV/Lingo-1-shRNA组运动功能改善最明显。 4.侧脑室注射LV/Lingo-1shRNA (2)后第30天,5×107TU/mlLV/Lingo-1-shRNA组和5×108TU/mlLV/Lingo-1-shRNA组髓鞘密度明显高于未治疗组(P0.05,P0.01),其中5×108TU/mlLV/Lingo-1-shRNA组髓鞘修复最佳,但仍未达正常水平(P0.05)。 结论：侧脑室注射LV/Lingo-1shRNA是一种沉默EAE小鼠脑内Lingo-1表达的有效方式。Lingo-1下调可改善EAE小鼠运动功能及促髓鞘修复,但效果并不随LV/Lingo-1-shRNA剂量增加而增强。
[Abstract]:Research background
Multiple sclerosis (MS) is a demyelinating disease of central nervous system, is one of the common diseases of the nervous system of young people and disability. Remyelination failure and axonal injury is the pathological basis of MS patients left permanent neurological damage, which can lead to repeated demyelination axonal injury. So fixed as soon as possible to prevent the damage of axonal remyelination, and the key to reducing disability. Lysine repeats and immunoglobulin domains (Leucine rich repeat and Ig domain containing1, Lingo-1) is a central nervous system myelination cells (oligodendrocyte differentiation) negative regulatory factor.EAE is present in multiple sclerosis animal recognized are widely used in the study model.
In this study, we inhibit Lingo-1 expression through RNA interference, observe the effect of Lingo-1 inhibition on oligodendrocytes and EAE, and explore its mechanism, so as to make some useful attempts for the next Lingo-1 treatment of multiple sclerosis. This study is divided into three parts.
The first part of the construction and screening of Lingo-1shRNA lentivirus vector
Objective: to screen the Lingo-1shRNA lentivirus vector with high expression silencing efficiency in mouse oligodendrocyte Lingo-1.
Method锛，

本文编号：1518076